基于分子对接技术HSP27与β受体激动剂结合能力的探索

发布时间：2020-04-20 09:56

【摘要】：目的β肾上腺素受体激动剂(简称β受体激动剂)在食品中的非法添加一直是影响中国居民健康的热点问题之一,尤其多种β受体激动剂的混合使用以及新型结构类似物的出现,引起居民对食品安全问题的恐慌,并且增加了市场监管的难度。因此,β受体激动剂多残留快速检测技术成为社会发展的新需求。该研究主要利用分子对接技术将人工表达的β_2肾上腺素受体(β_2 adrenergic receptor,β_2AR)和热休克蛋白27(heat shock protein 27,HSP27)与β受体激动剂分别进行分子对接,比较他们结合能力的差异性,探索HSP27用于β受体激动剂多残留检测的可能性。方法1.将HSP27和β_2AR分别与β受体激动剂类小分子药物进行分子对接,比较它们与β受体激动剂类小分子药物结合能力的差异性。2.将β_2AR基因转入大肠杆菌BL21,表达出具有功能活性的β_2AR蛋白,对诱导表达条件进行优化,并对表达的β_2AR蛋白进行纯化。3.将HSP27基因转入大肠杆菌BL21,表达出具有功能活性的HSP27蛋白,对诱导表达条件进行优化,并对表达的HSP27蛋白进行纯化。4.ELISA方法对β_2AR和HSP27与β受体激动剂类小分子药物结合能力进行验证。5.将HSP27用于检测3种β受体激动剂类小分子药物,建立标准曲线,计算检出限值,探索HSP27用于β受体激动剂多残留检测方面的可能性。结果1.分子对接结果克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗三种β受体激动剂分别与HSP27和β_2AR的对接模型图显示:在其形成的“配基结合小袋”中,HSP27和β_2AR与β受体激动剂类小分子药物依靠疏水键和氢键相互作用。15组对接结果中9组HSP27的分子对接总评分值高于β_2AR。配对t检验分析它们结合能力的差异性具有统计学意义(P=0.03)。2.β_2AR蛋白的表达与纯化结果重组β_2AR基因在大肠杆菌BL21中成功表达出β_2AR蛋白,蛋白大小为47KD左右,诱导表达条件:在细菌生长对数期(OD=0.6~0.9)加入浓度为1.0mmol/L的IPTG,37℃,220 r/min,振荡培养16 h。经超声破碎、离心后留取上清,在浓度为300 mmol/L咪唑洗脱液下纯化出蛋白。3.HSP27蛋白的表达与纯化结果HSP27基因在大肠杆菌BL21中成功表达出HSP27蛋白,蛋白大小为27 KD左右,诱导表达条件:在细菌生长对数期(OD=0.6~0.9)加入浓度为0.8 mmol/L的IPTG,37℃,220 r/min,振荡培养16 h。经超声破碎、离心后留取上清,在浓度为250 mmol/L咪唑洗脱液下纯化出蛋白。4.ELISA活性鉴定结果ELISA方法进行其活性鉴定,结果表明:HSP27蛋白和β_2AR蛋白与克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗三种β受体激动剂的酶标记物均能够发生特异性反应,HSP27的OD值分别为0.685,0.662和0.525。β_2AR的OD值分别为0.448、0.320和0.362。5.HSP27在β受体激动剂检测方面的应用HSP27用于3种β受体激动剂类药物检测的结果显示,在1μg/L~1000μg/L范围内,HSP27与3种β受体激动剂具有较好的线性关系,莱克多巴胺和非诺特罗与克伦特罗交叉反应率分别为52.6%和29.7%,检出限值为1.53μg/L。克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗的添加回收率范围分别为52.7%~77.3%,51.7%~71.3%和52%~76.8%,重复试验中变异系数均小于15%,表明HSP27在3种β受体激动剂类药物检测中具有较好的重复性。结论通过分子对接技术,本研究发现HSP27与β受体激动剂具有较强的结合能力,并发现HSP27在β受体激动剂的多残留检测方面的作用,为β受体激动剂的多残留检测技术的建立提供新的思路和理论依据。
【图文】：

3 结果3.1 分子对接结果3.1.1 分子对接模拟图分析15 种 β 受体激动剂类小分子药物在 SYBYL 软件中按事先设定的程序，分别与 HSP27 和 β2AR 进行分子对接，并在 15 种 β 受体激动剂中选取 3 种具有代表性的小分子药物，分别是克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗，ELISA 对对接结果进行验证。15 种 β 受体激动剂类小分子药物分别与 HSP27 和 β2AR 的分子对接模型图如图 3.1 和 3.2 所示，β 受体激动剂类小分子药物与 HSP27 和 β2AR大分子结构分别在其大分子结构形成的“配基结合小袋”中依靠疏水键和氢键相互作用，但同种 β 受体激动剂在 HSP27 和 β2AR 大分子结构中结合形态不同。

别与 HSP27 和 β2AR 进行分子对接，并在 15 种 β 受体激动剂中选取 3 种具有代表性的小分子药物，分别是克伦特罗、莱克多巴胺和非诺特罗，ELISA 对对接结果进行验证。15 种 β 受体激动剂类小分子药物分别与 HSP27 和 β2AR 的分子对接模型图如图 3.1 和 3.2 所示，，β 受体激动剂类小分子药物与 HSP27 和 β2AR大分子结构分别在其大分子结构形成的“配基结合小袋”中依靠疏水键和氢键相互作用，但同种 β 受体激动剂在 HSP27 和 β2AR 大分子结构中结合形态不同。A B C图 3.1 HSP27 与 β 受体激动剂类药物分子对接模型图注：A：HSP27 与克伦特罗；B： HSP27 与莱克多巴胺；C：HSP27 与非诺特罗
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R155.5

【参考文献】

相关期刊论文 前10条

1 李丹;王守伟;臧明伍;张凯华;张哲奇;赵金杨;;我国肉类食品安全风险现状与对策[J];肉类研究;2015年11期

2 杨敏;陈丹;姚冬生;谢春芳;刘大岭;;β-激动剂核酸适配体电化学生物传感器的研制[J];中国生物工程杂志;2015年11期

3 蒋芦荻;贺昱u&;陈茜;陶欧;李贡宇;张燕玲;;基于分子对接技术的高频降脂药对作用机制研究[J];中国中药杂志;2015年12期

4 杨德秋;杨潇;;基于分子对接技术的农药敏感乙酰胆碱酯酶的虚拟筛选[J];现代农药;2015年02期

5 颜春荣;张波;方萍;王多娇;徐春祥;;猪肉中19种β-受体激动剂的液相色谱串联四极杆-飞行时间质谱(Q-TOF)筛查和确证方法研究[J];分析试验室;2015年01期

6 王玲;潘亚男;;分子印迹固相萃取技术在兽药残留分析中应用的研究进展[J];黑龙江畜牧兽医;2014年03期

7 任洁;魏静;;分子对接技术在中药研究中的应用[J];中国中医药信息杂志;2014年01期

8 吴坚;薛晓燕;王丽芳;郭小华;肖林林;;分子对接方法应用与发展[J];亚太传统医药;2013年12期

9 蒋雪松;许林云;卢利群;沈飞;周宏平;;生物传感器在食品污染物检测中的应用研究进展[J];食品科学;2013年23期

10 袁利鹏;卢倚群;孙远明;徐振林;雷红涛;;盐酸克伦特罗抗体纯化及直接竞争ELISA方法研究[J];食品科学;2013年14期

相关博士学位论文 前6条

1 刘亚楠;NF-κB-HSP27路径在热应激致内皮细胞凋亡中作用机制的研究[D];南方医科大学;2016年

2 王健;β激动剂直接竞争酶重组受体分析技术研究[D];中国农业科学院;2015年

3 毕言锋;基于高分辨质谱技术的β-受体激动剂在猪体内的代谢研究[D];中国农业大学;2014年

4 戚之琳;磷酸化HSP27对抗TNF-α诱导HeLa细胞凋亡的分子机制研究[D];南京师范大学;2014年

5 王培龙;β-受体激动剂类药物分子印迹和质谱分析技术研究[D];中国农业科学院;2012年

6 王迪;β_2受体的表达、纯化及在快速检测中的应用[D];中国农业科学院;2008年

相关硕士学位论文 前6条

1 李志成;表面增强拉曼光谱检测β受体激动剂的研究[D];广西大学;2015年

2 彭涛;胶体金免疫层析法快速定量检测猪尿中β2-受体激动剂残留的研究[D];南昌大学;2015年

3 高霞;Hsp27在乳腺浸润性微乳头状癌中的表达及其意义[D];天津医科大学;2013年

4 颜美雪;论我国食品安全监管制度的完善[D];山东大学;2013年

5 苏华;β_2-肾上腺素受体的纯化及其与药物相互作用研究[D];西北大学;2011年

6 李敏艳;猪β_2-肾上腺素能受体的克隆、表达及初步分离纯化[D];西北大学;2009年

本文编号：2634421