【摘要】：目的:砷是自然界中普遍存在的较为丰富的元素。砷以及砷的化合物是国际癌症研究中心(IARC)确认的人类I类致癌物。来自流行病学和实验研究的文献提示,砷对机体具有免疫调节作用,但砷诱导免疫调节作用的相关机制研究尚不完善。近年来,砷对免疫系统及免疫细胞的损伤逐渐成为研究的热点,树突状细胞(dendritic cell,DC)作为最强的专职抗原提呈细胞(antigen presenting cell,APC),在机体免疫防御反应中扮演免疫监视的角色。研究表明无机砷可通过多种机制诱发DC的免疫抑制效应。细胞自噬(autophagy)是细胞正常状态和病理状态下一种普遍存在的应激反应,也是真核细胞所特有的一种分解代谢途径。已有研究显示DC中的自噬可影响其固有免疫功能以及适应性免疫应答。通过查阅国内外有关文献,关于无机砷对DC自噬影响的研究尚不多见。本研究深入探讨无机砷对DC细胞溶酶体-自噬途径的可能影响,并进而探究关键转录因子EB(nuclear transcription factor,TFEB)对于DC的自噬-溶酶体途径以及在砷暴露所致DC免疫抑制效应中的可能作用,为砷对DC的免疫抑制作用的机制提供更为丰富的理论依据。研究方法:本研究以C57BL/6小鼠体外诱导培养的骨髓来源树突状细胞(bone marrow dendritic cell,BMDC)为研究对象,通过体外无机砷染毒以及不同的干预措施,观察和探究无机砷对BMDC自噬功能的影响。通过慢病毒感染技术过表达TFEB观察和探究TFEB对DC的自噬-溶酶体途径以及在无机砷诱导BMDC免疫抑制效应中的可能作用。具体研究方法如下:1.透射电镜观察自噬小体和溶酶体BMDC诱导培养至第六天收集,细胞离心后加入适量2.5%戊二醛(磷酸缓冲液配制)置于4℃冰箱固定2 h或更长时间。经过漂洗、固定、再漂洗、块染、梯度脱水、包埋剂梯度渗透、加热聚合等过程后,应用透射电镜观察双层膜自噬小体及溶酶体,保存记录。2.Western blot免疫印迹检测蛋白表达BMDC用不含血清的1640培养基重悬于6孔细胞培养板中培养。根据实验目的用特定浓度的LPS及无机砷处理6 h。处理后,轻轻吹打并收集细胞,提取BMDC蛋白,并测定蛋白浓度。根据目的蛋白的分子量进行SDS聚丙烯酰胺凝胶的配制,随后经过蛋白变性、蛋白上样、电泳、转膜、封闭、一抗孵育、二抗孵育、清洗,最后ECL发光检测LC3、Atg5、Atg12、Atg16L1、p-m-TOR/m-TOR、p62/SQSTM1、TFEB、Lamin B、LAMP1、LAMP2、Cathepsin D、Cathepsin L、Cathepsin S、Cathepsin B、Legumain/AEP、ATP6V1A、ATP6V1E1、ATP6V0A1和β-actin蛋白的表达水平。3.BMDC免疫荧光染色BMDC诱导培养第六天收集并进行LC3B免疫荧光染色。4%多聚甲醛固定15min,免疫染色洗涤液洗1min,3次。封闭液封闭,室温1 h。加兔抗LC3B单克隆抗体,4℃过夜。洗涤液洗1 min,3次。滴加标记绿色荧光的抗兔DyLight?488。洗涤液洗1 min,3次。避光条件下滴加含DAPI的防淬灭封片剂。在Nikon 90I荧光显微镜下观察并采集照片。4.Real-time PCR分析基因转录活性BMDC诱导培养第六天收集,轻轻吹打收集细胞,1300 rpm/min离心弃上清,用预冷PBS重悬后再次离心弃上清,用Trizol法提取BMDC总RNA,测定所提取的RNA浓度和纯度,用GoScript~TMM Reverse TranscriptionSystem反转录试剂盒将mRNA逆转录为cDNA。实时定量PCR分析采用GoTaq?qPCR Master Mix试剂盒。采用Q6实时定量PCR仪进行检测,分析处理数据。5.Lysotracker Red染色BMDC诱导培养第六天收集,取1μl Lysotracker Red加入到20 ml细胞培养液中,配制终浓度为50 nM的工作液。细胞以合适密度接种于6孔板玻片上,去除细胞培养液,加入37℃预温的Lysotracker Red工作液,孵育30 min后换正常培养基。激光共聚焦显微镜观察,拍照分析。6.TFEB慢病毒感染细胞诱导培养第六天,用完全培养基制备1×10~5个/ml的细胞悬液,接种到6孔板中。根据细胞MOI及病毒滴度,分别加入相应的慢病毒LV-TFEB及阴性对照病毒LV-CON病毒量,37℃培养10 h。中途补充完全培养基以保持细胞活性,感染约72 h后,观察感染效率。7.流式细胞术测定BMDC表面分子收集各个实验组BMDC单细胞悬液,调整细胞个数约至2×10~5个/ml,离心后弃上清,将BMDC重悬于100μl stain buffer,根据流式荧光抗体说明书,按照适当的比例加入MHC II-APC流式荧光抗体进行标记染色。4℃避光孵育30 min,清洗后混匀,使用BD流式细胞仪进行上机检测。8.BMDC上清液中细胞因子的ELISA测定按照ELISA试剂盒说明书进行检测,首先包被TNF-α、IL-1β和IL-6抗体。第二天,弃去板中液体并清洗三次,加入1×ELISAPOT稀释液,室温下孵育1 h后,清洗三次。用1×ELISAPOT稀释液梯度稀释标准蛋白,加入标准品和待测BMDC上清液,封板后室温孵育2 h,清洗三测后,加入Avidin-HRP,室温孵育l h。弃去液体并清洗六次。加入1×TMB substrate solution,室温下避光孵育15 min。最后加入ELISA终止液,使用酶标仪检测并分析。9.统计学分析应用SPSS13.0软件对数据进行统计学分析,实验结果表示为mean±SD。各组间的差异比较运用单因素方差分析(ANOVA),方差齐,采用SNK法进行两两比较;方差不齐,采用Dunnett’s T3法进行两两比较。p0.05为差异有统计学意义。结果:1.无机砷暴露导致BMDC自噬体数量增多、LC3蛋白水平升高以及Map1lc3b基因转录活性的增强与Con组相比,1μM As染毒12 h后可见一定数量自噬小体;在LPS诱导的促成熟DC中,与Unt组相比,1μM As染毒12 h可以诱导DC形成更多的自噬小体。Western blot检测结果显示,不同浓度的As(0.25,0.5和1μM)暴露6 h后,均能明显诱导BMDC LC3 I和LC3 II蛋白表达的增加(p0.05)。1μM As染毒12 h后,LC3荧光强度明显增强。此外,1μM As可诱导BMDC Map1lc3b转录活性显著增强且差异有统计学意义(p0.05)。2.无机砷对BMDC中Atg5、Atg12-Atg5、Atg16L1及p-mTOR/mTOR蛋白表达的影响Western blot结果显示,不同浓度As处理组的Atg5、Atg12-Atg5和Atg16L1表达未见差异性变化。而不同浓度的As剂量依赖性的诱导了BMDC p-mTOR表达下降,差异有统计学意义(p0.05)。mTOR总蛋白表达水平基本保持不变。3.无机砷诱导BMDC自噬具有mTOR依赖性与未处理组相比,Rap处理组可下调p-mTOR的表达,以及上调LC3 II/LC3 I的显著表达(p0.05);与As处理组相比,Rap与As共同处理组可诱导LC3 II/LC3I的升高,差异有统计学意义(p0.05)。4.无机砷上调BMDC中p62/SQSTM1蛋白表达和Sqstm1的转录活性与未处理组相比,不同浓度的As(0.25,0.5和1μM)剂量依赖性的诱导p62蛋白表达的增加,且在As浓度为1μM时差异有统计学意义(p0.05)。并且,从6 h起无机砷即可诱导p62蛋白表达明显增加,到24 h到达一个高峰,差异均有统计学意义(p0.05)。此外,1μM As还能明显诱导BMDC Sqstm1转录活性增强,且有显著性差异(p0.05),与砷诱导LC3和SQSTM1/p62蛋白表达结果基本一致。5.无机砷可抑制BMDC自噬流与As处理组相比,CQ处理组LC3 II/LC3 I的比值显著下调(p0.05),说明无机砷不仅增加自噬体的合成,而且抑制了自噬体的降解。此外,与未处理组相比,As处理组、CQ处理组以及CQ+As联合处理组的自噬特异性降解底物p62蛋白水平均显著性上调(p0.05),且升高倍数基本一致,更加说明无机砷抑制了LPS诱导促成熟BMDC的自噬流,导致自噬降解底物如p62蓄积。6.无机砷影响TFEB核转位本研究中,用1μM的As处理细胞12 h后,分别收集BMDC核蛋白、胞浆蛋白和全蛋白。我们使用western blot方法检测了TFEB的蛋白表达水平,发现无机砷可明显下调LPS诱导促成熟BMDC中TFEB全蛋白及核蛋白表达,差异有统计学意义(p0.05),而胞浆蛋白中TFEB的表达未见显著性变化。以上结果说明无机砷可抑制BMDC TFEB核转位。7.无机砷抑制BMDC溶酶体发生数量、膜完整性和酸化功能As可使LPS诱导促成熟BMDC中Lysotracker red红色荧光强度明显降低,表达量明显减少。上述结果提示,无机砷可降低LPS诱导促成熟BMDC酸性溶酶体数量。透射电镜可观察到在未处理组中,溶酶体中含有摄食的物质,并对其进行消化,溶酶体膜大致完整;而在As处理的LPS促成熟BMDC中,可观察到溶酶体膜不完整的现象。另外,western blot结果显示,无机砷可下调LPS诱导促成熟BMDC中LAMP1和LAMP2,以及溶酶体组织蛋白酶CTSD、CTSL、CTSS以及AEP的蛋白表达水平。8.TFEB缓解无机砷抑制BMDC溶酶体相关蛋白的表达在未给予砷处理(Unt)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB组BMDC中LAMP2、CTSL、CTSB、CTSD和AEP蛋白表达水平明显上升,说明TFEB的过表达可诱导溶酶体相关膜蛋白LAMP2的表达;在给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB组BMDC中LAMP2、CTSL、CTSB、CTSD和AEP蛋白表达水平也明显上升。9.TFEB缓解无机砷抑制BMDC自噬流无论在未给予砷处理(Unt)组还是砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB组BMDC中LC3 I和LC3 II以及p62的蛋白水平均显著下降(p0.05)。另外,与蛋白表达结果一致,在给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可下调BMDC中Map1lc3b的mRNA表达,而Sqstm1基因表达水平未见显著性改变。10.TFEB对无机砷抑制BMDC抗原提呈分子、协同刺激分子和趋化因子表达的影响在给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可上调BMDC中MHC II分子的表达,以及Cd83和Cd40的mRNA表达,但无统计学差异;而Cd86和Cd80基因表达水平未见显著性改变。另一方面,我们还观察到在给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可上调BMDC中Ccr5和Ccr7的mRNA表达,且上调Ccr5的基因表达差异有统计学意义(p0.05)。11.TFEB对无机砷抑制的BMDC趋化因子炎性细胞因子表达的影响ELISA检测结果显示,在给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可显著性上调BMDC分泌于上清液中TNF-α的表达(p0.05)。而无论在未给予砷处理(Unt)组还是给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可上调BMDC分泌于上清液中IL-1β的表达。Realtime-PCR检测发现,与ELISA结果基本一致,无论在未给予砷处理(Unt)组还是给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可上调BMDC中Tnf-α和Il-1β的基因转录活性,且差异均有统计学意义(p0.05)。12.TFEB对无机砷抑制的BMDC中Th1型细胞因子IL-12表达的影响ELISA检测结果显示,无论在未给予砷处理(Unt)组还是给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可显著性上调BMDC分泌于上清液中IL-12p70的表达(p0.05)。另一方面进行realtime-PCR检测,与ELISA结果基本一致,在未给予砷处理(Unt)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可上调BMDC中Il-12a和Il-12b的基因转录活性,且差异均有统计学意义。在给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可上调BMDC中Il-12a和Il-12b的基因转录活性,但无统计性差异。13.TFEB对无机砷抑制的BMDC中Th17型细胞因子IL-6和IL-23的表达的影响ELISA检测结果显示,无论在未给予砷处理(Unt)组还是给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可上调BMDC分泌于上清液中IL-6的表达,且前者具有统计性差异。另一方面,与ELISA结果基本一致,realtime-PCR结果显示无论在未给予砷处理(Unt)组还是在给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB均可上调BMDC中Il-6的基因转录活性,且差异均有统计学意义(p0.05)。此外,LV-TFEB均可轻微上调BMDC中Il-23a的基因转录活性,但差异无统计学意义。14.TFEB对无机砷诱导的BMDC中Treg型细胞因子IL-10和TGF-β表达的影响ELISA检测结果显示,无论在未给予砷处理(Unt)组还是给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB可上调BMDC分泌于上清液中IL-10的表达,且前者具有统计性差异。另一方面,用realtime-PCR方法对细胞中Il-10的mRNA表达水平进行检测,无论在未给予砷处理(Unt)组还是在给予砷处理(As)组中,与LV-NC组相比,LV-TFEB均可下调BMDC中Il-10的基因转录活性,且后者差异均有统计学意义(p0.05)。此外,LV-TFEB均可轻微上调BMDC中Tgf-β的基因转录活性,但均没有统计性差异。结论:1.无机砷能够影响BMDC自噬-溶酶体途径。一方面,能够mTOR依赖性的诱导BMDC自噬体增多,同时还能够阻碍成熟BMDC的自噬流,对溶酶体功能也具有一定的抑制作用。2.过表达TFEB可以在一定程度上增强BMDC溶酶体功能和缓解无机砷诱导的BMDC受阻自噬流,同时对无机砷诱导的BMDC免疫抑制效应起到一定的拮抗作用。
【图文】：
中国医科大学博士学位论文3 结果3.1 无机砷对 BMDC 自噬体形成的影响3.1.1 无机砷暴露导致自噬体数量增多透射电镜结果如图所示（图 3.1.1），用浓度为 1 μM 的 As 单独处理或与 25 ng/mlLPS 共同处理细胞 12 h 后，我们可以观察到，与 Con 组相比，1 μM As 染毒 12 h后可见一定数量自噬小体；在 LPS 诱导的促成熟 DC 中，与 Unt 组相比，1 μM As染毒 12 h 可以诱导 DC 形成更多的自噬小体。
（p < 0.05）。另一方面，从图 3.1.2 B 可以看出，在 LPS 诱导的促成熟 BMDC 中与 Unt 组相比，不同浓度的 As（0.25, 0.5 和 1 μM）剂量依赖性的诱导了 LPS 促成熟 BMDC LC3 I 和 LC3 II 蛋白表达的增加，且诱导 LC3 II 蛋白表达增加差异均有统计学意义（p < 0.05）。此外，LC3 II/ LC3 I 在 As 浓度为 1 μM 时有显著性差异（p < 0.05）。此外，为了更好的验证无机砷对 BMDC LC3 蛋白表达的影响，我们观察了经μM As 染毒 12 h 后 LC3 蛋白荧光表达情况。用浓度为 1 μM 的 As 单独处理或与 2ng/ml LPS 共同处理细胞 12 h 后，实验结果如图所示（3.1.2 C），最左图是 LC3 蛋白荧光图，中间是 BMDC 胞核的 DAPI 染色，最右图为蛋白和胞核的合成图。合成图中，我们可以发现，在 Con 组中，LC3 蛋白有一定的表达量，与 Con 组相比，1 μMAs 处理组中 LC3 蛋白的表达量增加；在 LPS 诱导的促成熟 BMDC 中，与 Unt 组相比，，1 μMAs 染毒 12 h 后，LC3 荧光强度明显增强，说明与 western blot 结果一致无机砷可诱导 BMDC 的 LC3 蛋白表达增加。
【学位授予单位】：中国医科大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
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