苯并芘在BMP2诱导间充质干细胞成骨分化中的作用及机制研究

发布时间：2020-04-21 22:40

【摘要】：目的:研究苯并芘(benzo[a]pyrene,BaP)对骨形态发生蛋白-2(bone morphogenetic proteins 2,BMP2)诱导的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSCs)成骨分化的影响,并对其相关调控机制进行初步研究。方法:用腺病毒Ad-BMP2感染间充质干细胞,RT-PCR检测1d时BMP2及芳香烃受体(aryl hydrocarbon receptor,AhR)的表达。随后加入不同浓度BaP处理,检测BaP对BMP2诱导的间充质干细胞成骨分化的影响:通过检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的染色和活性测定其对BMP2诱导成骨分化早期的影响,检测茜素红S染色观察其对BMP2诱导的成骨分化晚期的影响。Western blot检测Runx2,OCN,OPN和BMP/Smad信号通路中p-Smad1/5/8的表达。应用AhR拮抗剂CH223191后,观察其对上述成骨分化指标及BMP/Smad信号通路的影响。为进一步明确其具体机制,用生物信息学分析发现成骨相关BMPRⅡ和Hey1为苯并芘的靶基因,用RT-q PCR检测苯并芘对BMPRⅡ和Hey1的调控,用Western blot和细胞免疫荧光检测BMPRⅡ的蛋白表达水平,应用AhR拮抗剂CH223191后,检测BMPRⅡ和Hey1的变化。结果:用腺病毒Ad-BMP2感染间充质干细胞时,BMP2的表达水平显著增高,AhR的表达则无显著差异。不同浓度的BaP处理感染Ad-BMP2的间充质干细胞后,BaP可以剂量依赖的方式抑制BMP2诱导的ALP活性、钙盐沉积;qRT-PCR结果显示BaP可以剂量依赖的方式抑制BMP2诱导成骨相关基因Runx2,ALP和OSX的表达。Western Blot检测结果显示BaP可以剂量依赖的方式抑制BMP2诱导的Runx2、OCN、OPN及p-Smad1/5/8的表达。应用AhR拮抗剂CH223191后,其可部分逆转BaP对BMP2诱导的间充干细胞早晚期成骨分化及BMP2/Smad信号通路的抑制作用。BaP抑制BMPRⅡ的蛋白水平的表达,并上调Hey1的表达,CH223191可以逆转BaP对BMPRⅡ表达的抑制作用,并抑制BaP对Hey1的激活作用。结论:BaP可通过AhR抑制BMP2介导的促进间充质干细胞成骨分化,其作用机制可能是通过Ah R抑制BMPRⅡ表达,同时激活Hey1增强其对BMP2负反馈调节作用,从而影响BMP/Smad信号通路的激活。
【图文】：

level of BMP2 of B. D: The relative mRNA level of AhR of B. E: Ad-GFP and Ad-BMP2 infectedMEFs for 48h. F and G: the gene expression level of BMP2 and AhR in MEFs that infectedAd-BMP2 for 48h by RT-qPCR. ***P<0.001, ns: no significant difference.2.2 BaP抑制BMP2诱导的MSCs早期成骨分化指标ALPC3H10T1/2 细胞和 MEF 细胞在不感染或感染 Ad-BMP2 的情况下，分别给予不同浓度 BaP 处理，，C3H10T1/2 细胞处理 7d，MEF 细胞处理 5d。结果显示，与对照组相比，单独使用 BaP 处理后，ALP 染色和活性在 C3H10T1/2 细胞(图 2A 和2B)和 MEF 细胞(图 2C 和 2D)中明显减弱，且有一定的剂量依赖性，这表明单独BaP 可以剂量依赖的方式抑制 MSCs 的早期成骨分化指标 ALP；与对照组 BMP2组相比，BMP2 和 BaP 共同处理后，ALP 染色和活性在 C3H10T1/2 细胞(图 2A 和2B)和MEF细胞(图2C和2D)中明显减弱，且有一定的剂量依赖性。该结果表明, BaP可以剂量依赖的方式抑制 BMP2 诱导的 MSCs 的早期成骨分化。

28图 6CH223191可部分逆转BaP对BMP2诱导C3H10T1/2细胞的早期成骨分化的抑制作用Fig. 6 CH223191 can rescue the toxicologic effects of BaPon BMP2-induced the earlyoesteogenic differentiation of MSCsA: C3H10T1/2 细胞的 ALP 染色结果（7d）；B: ALP 活性；C: MEF 细胞的 ALP 染色结果（5d）；D: ALP 活性。***P<0.001，**P<0.01，*P<0.05VS BMP2 组；###P<0.001，#P<0.05 VS BMP2+BaP+DMSO 组。A: The result of ALP staining of C3H10T1/2cells (7d); B: ALP activity; C: The result of ALPstaining of MEFs (5d); D: ALP activity. ***P<0.001, **P<0.01, *P<0.05VS BMP2;###P<0.001,#P<0.05 VS BMP2+BaP+DMSO.
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114

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本文编号：2635822