免疫磁性复合物的制备及其在副溶血性弧菌检测中的应用

发布时间：2020-04-25 08:39

【摘要】：目的近年来由副溶血性弧菌引起的食品安全恶性事件频发,已经成为了我国首要的食源性致病菌,因此建立对副溶血性弧菌的快速检测方法,对实施食品安全监控,预防由副溶血性弧菌引起的食品安全事件十分必要。现有的副溶血性弧菌检测方法存在着食品样品的基质复杂,样品中病原菌含量低,需要对样本进行复杂费时的的前处理和预增菌的问题,本课题旨在建立并优化一种副溶血性弧菌的高效的样品前富集方法,并结合聚合酶链式反应(PCR)技术,建立一种副溶血性弧菌的快速检测体系。方法制备可特异性识别副溶血性弧菌的兔多克隆抗体、鸡卵黄抗体和噬菌体展示多肽,将三者分别作为生物识别探针,包被于磁珠表面,应用于免疫磁性分离技术中,从而制备出三种不同的免疫磁性复合物。根据免疫磁性复合物的用量、富集时间及富集效率进行比较,评价出最佳的免疫磁性复合物。结合免疫磁性分离技术和聚合酶链式反应(PCR)技术,建立一种副溶血性弧菌的快速检测体系,并对这种检测体系进行评价。结果(1)以副溶血性弧菌灭活菌株作为抗原,免疫SPF级蛋鸡,制备了鸡卵黄抗体,并采用PEG-6000沉淀法纯化抗体,采用iELISA方法检测抗体效价和特异性,采用电泳及蛋白浓度定量试剂盒方法测定了抗体纯度及蛋白含量。结果显示,本课题制备的鸡卵黄抗体效价为1:128000;特异性较好,能特异性识别副溶血性弧菌,而不能与粪肠球菌、阪崎肠杆菌、阴沟肠杆菌、克雷伯氏菌、肺炎克雷伯氏菌、布氏柠檬酸杆菌、李斯特菌、粘质沙雷氏菌、大肠杆菌和奇异变形杆菌结合;抗体杂带较少条带清晰;抗体蛋白含量为7.318 mg/mL;(2)以副溶血性弧菌灭活菌株作为抗原,采用噬菌体展示技术从肽库中淘选特异性结合副溶血性弧菌的多肽,经三轮生物淘选程序后,随机挑选10个噬菌体克隆,并计算每轮程序后的噬菌体回收率。采用ELISA方法检测噬菌体克隆对副溶血性弧菌的结合能力,对阳性噬菌体克隆进行DNA的提取及测序,结合其流行程度及ELISA结果,选择与副溶血性弧菌亲和力最强的噬菌体展示多肽合成及表征,用生物分子作用系统检测其特异性。结果显示,噬菌体淘选实验亲和筛选效果较好,噬菌体回收率随淘选轮数逐渐升高;挑取的10个噬菌体克隆均为阳性,且C1结合副溶血性弧菌能力最强,对噬菌体克隆进行DNA提取并测序,多肽V1对应着多个噬菌体克隆,流行度最高,且C1对应的多肽序列也是V1,故选取噬菌体展示多肽V1序列进行合成,修饰以生物素以便其应用;采用生物相互作用系统评价噬菌体展示多肽V1的特异性,该多肽特异性较好,能特异性识别副溶血性弧菌,而不能识别沙门氏菌、单增李斯特菌、大肠杆菌及克雷伯氏菌;(3)将兔多克隆抗体、鸡卵黄抗体和噬菌体展示多肽三者作为生物识别探针分别与磁珠偶联,制备三种免疫磁性复合物,对相应的免疫磁性分离方法进行优化及比较。在磁珠用量方面,兔多克隆抗体-磁珠最佳用量需1.4 mg,鸡卵黄抗体-磁珠需1.2 mg,而噬菌体展示多肽V1-磁珠只需0.3 mg;在富集时间方面,兔多克隆抗体-磁珠和鸡卵黄抗体-磁珠均需要60 min,而噬菌体展示多肽V1-磁珠只需30 min;在富集效率方面,兔多克隆抗体-磁珠能够达到73.20%,鸡卵黄抗体抗体-磁珠能够达到79.25%,噬菌体展示多肽-磁珠能够高达90.49%,结果表明,在制备免疫磁性复合物方面,噬菌体展示多肽相对两种抗体无论是在用量时间,还是富集效率上,都显示了绝对优势。因此,本实验选择噬菌体展示多肽V1-IMS作为副溶血性弧菌检测的前处理方法,进行快速检测体系的建立;(4)利用噬菌体展示多肽V1-IMS对副溶血性弧菌进行富集分离,并联合PCR扩增方法,放大检测信号检测副溶血性弧菌。结果表明,该检测体系灵敏度高,特异型好,整个检测体系在180 min内能够完成,对副溶血性弧菌纯菌液或模拟样本的最低检测限均为10~2cfu/m L,且具有较好的特异性,能够满足对食品样品中副溶血性弧菌快速灵敏的检测的要求;结论本实验基于噬菌体展示技术和免疫磁分离技术建开发了一种高效特异的食品样品前处理方法,并结合PCR建立了一种特异性好、灵敏度高且方便快速的副溶血性弧菌检测方法,为副溶血性弧菌乃至其他食源性病原菌的快速检测的奠定了一定的实验基础。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R155.5

【参考文献】