Atg7基因敲除影响三邻甲苯磷酸酯诱导的Neuro-2a细胞损伤的机制研究

发布时间：2020-04-25 04:41

【摘要】：目的有机磷化合物(Organophosphorus,OPs)在农业、工业中有着非常广泛的应用。据统计全世界每年约有300万人暴露于有机磷化合物。部分有机磷化合物能够诱导迟发性神经病变,称为有机磷化合物诱导的迟发性神经病(Organophosphorus-induced delayed neuropathy,OPIDN)。三邻甲苯磷酸酯(Tri-ortho-cresyl phosphate,TOCP)是最早被鉴定为能够诱导人类OPIDN的有机磷化合物。OPIDN的病理学特征为Wallerian样变性,表现为神经管和神经丝的丢失,线粒体和囊泡等的堆积,这提示可能存在异常的蛋白质降解机制。课题组前期通过TOCP染毒整体动物和离体细胞均发现细胞中自噬活性发生改变,提示自噬在OPIDN的发生过程中发挥一定作用。到目前为止,OPIDN发病机制的研究尚不透彻,自噬在OPIDN中发挥的具体作用及其机制并不明确。在本研究中我们利用TOCP染毒分化后的野生型和自噬缺陷型(Atg7-/-)小鼠神经瘤母细胞(Neuro-2a,N2a),作为在该研究中有机磷神经毒性的体外模型,并利用暴露于TOCP的罗曼母鸡作为体内模型,来探讨自噬在TOCP引起Neuro-2a细胞轴突和细胞体损伤中的作用,以期揭示自噬与TOCP导致的神经细胞损伤间的内在关系。方法1.建立TOCP染毒N2a细胞模型野生型N2a细胞和自噬缺陷型(Atg7-/-)N2a细胞贴壁后,加入含10μM视黄酸(Retinoic acid,RA)的2%血清培养液诱导分化48h。分别使用0 μM、5μM、10 μM的TOCP处理诱导分化成功的两种细胞,培养24h后到达染毒终点。2.形态学观察细胞经TOCP处理24 h后,每组中随机选取20个视野进行显微镜下观察(200 X),并拍照记录。使用TCapture记录每个视野中10个细胞的轴突长度,进行数据分析。3.细胞线粒体膜电位检测使用JC-1线粒体膜电位测定试剂盒检测N2a细胞的线粒体膜电位。将野生型N2a细胞和Atg7-/-细胞用不同浓度TOCP处理后,在37℃下加入JC-1染色工作液(5 μg/mL)孵育20分钟后用JC-1染色缓冲液(1X)洗涤。荧光显微镜下观察染色细胞并拍照。荧光酶标仪检测JC-1单体(绿色荧光,激发光490 nm,发射光530 nm)和JC-1聚合物(红色荧光,激发光525 nm,发射光590 nm)荧光强度。4.蛋白免疫印迹实验利用RIPA裂解液提取TOCP处理的野生型N2a细胞和Atg7-/-细胞全蛋白,检测Wallerian变性相关蛋白NMNAT、SARM1、DLK等蛋白的表达,以及calpain降解系统、内质网应激、程序性坏死相关蛋白的表达变化。利用NE-PER Nuclear and Cytoplasmic Extraction试剂盒提取细胞核蛋白样品,检测内质网应激相关核因子蛋白表达水平。5.实时荧光定量PCRTRIzol法提取不同剂量处理的野生型N2a细胞和Atg7-/-细胞总RNA,逆转录成cDNA,利用UPL荧光探针和实时荧光定量PCR检测抗氧化基因的相对表达水平。6.动物实验建立TOCP诱导动物OPIDN模型:选取30只健康成年罗曼母鸡,适应性喂养3天后,随机均分为5组,分别为对照组、1D、5D、10D、21D组。一次性经口灌胃进行TOCP染毒,灌胃剂量为750mg/kg,对照组不做处理。每天观察并记录动物双下肢的活动情况和步态变化,按照八级评分标准对母鸡OPIDN临床症状的进展进行评分。在TOCP染毒1天、5天、10天、21天时,断头处死相应组别的动物,在冰袋上迅速取出动物的脊髓、胫神经等部位。建立OPIDN干预动物模型:另取30只健康成年罗曼母鸡,适应性喂养3天后,随机均分为6组,分别为对照组、0D、1D、5D、10D、21D组。对照组不做任何处理,其余组别提前24h皮下注射PMSF,剂量为90mg/kg,再一次性经口灌胃进行TOCP染毒,灌胃剂量为750mg/kg。每天观察并记录动物双下肢的活动情况和步态变化,按照八级评分标准对母鸡OPIDN临床症状的进展进行评分。在TOCP染毒0天、1天、5天、10天、21天时,断头处死相应组别的动物,在冰袋上迅速取出动物的脊髓、胫神经等部位。提取脊髓、胫神经组织总蛋白,利用蛋白免疫印迹实验检测Wallerian变性相关蛋白的表达水平。结果1.Atg7基因敲除对TOCP诱导的N2a细胞轴突损伤的影响(1)TOCP处理对N2a细胞轴突的影响:TOCP处理引起分化的N2a细胞的轴突明显缩短,轴突损伤随着染毒剂量的升高而增加。Atg7基因敲除对TOCP诱导N2a细胞产生的轴突损伤具有保护作用。(2)促轴突存活因子与促轴突损伤因子蛋白表达的变化:TOCP染毒后,野生型细胞和Atg7-/-细胞中NMNAT2和SCG10的蛋白水平均显著下降,而SARM1和p-CRMP2的蛋白表达含量均呈现剂量依赖性增加。在相同剂量的TOCP暴露下,Atg7-/-细胞中NMNAT2和SCG10蛋白的表达含量均高于野生型细胞,SARM1蛋白的表达均低于野生型细胞。结果提示Atg7基因敲除能够减缓TOCP诱导N2a细胞中促轴突存活因子水平的下降和促轴突损伤因子水平的升高。(3)DLK-MKK4-MAPK信号通路分子蛋白表达的变化:DLK和p-MKK4的蛋白水平在野生型细胞和Atg7-/-细胞中均明显增加,且p-P38和p-ERK1/2蛋白表达也增多。结果提示TOCP处理后N2a细胞中DLK-MKK4-MAPK信号通路被激活。(4)动物模型中Wallerian变性相关分子蛋白表达的变化:TOCP模型组的动物自第五天起,实验组动物双下肢开始出现轻微变化,行走偶有摇晃。OPIDN的症状进展迅速,动物双下肢力量越来越弱,行走协调度变差,脚步成外八字形,摇晃逐渐加剧甚至出现跌倒。到第15天时所有动物都完全瘫痪,此状态一直持续直到实验结束,未出现好转或恢复。对照组动物在实验期间未出现任何异常变化。PMSF干预组动物在实验期间站立和行走状态正常,未出现OPIDN症状。TOCP染毒模型脊髓与胫神经中p-MKK4(或SARM1)、p-JNK的水平均呈现时间依赖性的增加。,而在PMSF干预组脊髓和胫神经中p-MKK4、p-JNK的蛋白水平各组之间差异不具有统计学意义。(5)Calpain降解系统蛋白表达水平的变化:10μMTOCP染毒后,两种细胞中m-calpain和μ-calpain的蛋白表达量均上升,Calpastain蛋白的表达则呈现剂量依赖性的降低。结果支持TOCP诱导N2a细胞中calpain降解系统激活。2.Atg7基因敲除对TOCP诱导的N2a细胞体损伤的影响(1)细胞线粒体膜电位的变化:TOCP染毒引起两种细胞中红色荧光强度与绿色荧光强度的比值明显下降,线粒体膜电位下降,提示线粒体受到损伤。与野生型细胞相比,Atg7基因敲除能显著减轻TOCP诱导的N2a细胞线粒体损伤。(2)细胞内质网应激相关分子表达水平的变化:TOCP处理后,ATF6、CHOP在两种细胞中均呈现剂量依赖性增加。ATF4、p-eIF2a在野生型N2a细胞,10μM TOCP染毒组中的表达水平比对照组显著升高,但在Atg7-/-细胞中没有明显变化。(3)抗氧化相关分子表达的变化:给予TOCP染毒后N2a细胞中抗氧化基因的mRNA的表达均呈现剂量依赖性增加,而且在Atg7-/-细胞中mRNA的表达水平明显高于野生型N2a细胞。(4)细胞程序性坏死相关分子表达水平的变化:在野生型N2a细胞中RIP1和p-MLKL的表达水平都随TOCP剂量增大而升高,均高于在Atg7-/-细胞中的表达水平。给予TOCP后,N2a细胞中程序性坏死被激活,Atg7基因敲除对TOCP诱导的程序性坏死具有保护作用。结论1.TOCP诱导神经细胞产生轴突损伤,Atg7基因敲除对TOCP诱导神经细胞轴突和细胞体的损伤具有保护作用。2.TOCP诱导N2a细胞轴突损伤,与Wallerian变性中促轴突存活因子的消耗、促轴突损伤因子的增加有关,与Wallerian变性上游通路和calpain降解系统的激活有关。Atg7基因敲除能够缓解促轴突存活因子的消耗和促轴突损伤因子的增加。3.TOCP诱导N2a细胞胞体损伤,与诱导细胞内氧化应激、内质网应激、线粒体损伤、激活程序性坏死反应有关。Atg7基因敲除能够缓解TOCP诱导细胞产生的氧化应激、内质网和线粒体的损伤。
【图文】：

记的可溶性小分子蛋要；－溶酶解（ａｕｔｏｐｈａｇｙ－ｌｙｓｏｓｏｍａｌ邋ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）：主要负责清除一些长寿蛋白、蛋白聚合物，逡逑以及受损的细胞器等；③胞浆蛋白降解系统；如ｃａｌｐａｉｎｓ钙蛋白酶降解系统。逡逑自噬是真核细胞中高度保守的自我降解过程。当细胞受到营养缺乏或其他环逡逑境刺激时，便会启动自噬过程并将不需要的蛋白质和受损细胞器运输到溶酶体中逡逑进行降解［２８，３５］。一般根据细胞内自噬底物运送到溶酶体腔方式的不同，将自噬分逡逑为大自嗟（Ｍａｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）、小自嗤（Ｍｉｃｒｏａｕｔｏｐｈａｇｙ）、分子伴侣介导的自嗤逡逑（Ｃｈａｐｅｒｏｎｅ－ｍｅｄｉａｔｅｄ邋ａｕｔｏｐｈａｇｙ，邋ＣＭＡ）邋［３６］。在小自嗤发生过程中，细胞利用内逡逑陷或者凸起的溶酶体膜，来直接捕获降解底物，ＣＭＡ需要分子伴侣蛋白识别和逡逑转运可溶性蛋白质到溶酶体内降解，而大自噬的过程中会形成双层的自噬体逡逑（ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ），自嗤体最终和溶酶体融合后降解底物，这是与其他两种自嗤逡逑的最大不同［３５，３６］。通常说的自噬指的就是大自噬。逡逑

逦山东大学硕士学位论文逦逡逑降解［３７］。在自噬的起始阶段，由Ａｔｇｌ／ＵＬＫｌ激酶及其调节因子Ａｔｇｌ３、Ａｔｇｌ７来逡逑接受上游信号，如ｍＴＯＲ激酶的刺激，并与ＦＩＰ２００、ＡｔｇｌＯｌ形成复合物，该复逡逑合物转运至成核区后可以募集其他相关的蛋白［３８］。自噬囊泡的形成是３－磷酸磷逡逑脂酰肌醇ＰＩ３Ｐ依赖性的，需要Ｖｐｓ３４／ＰＩ３Ｋ复合物来介导［３８］。Ａｔｇｌ２－Ａｔｇ５－Ａｔｇｌ６Ｌ逡逑复合物和邋Ａｔｇ８／ＬＣ３邋（微管蛋白轻链邋３，邋Ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ邋３邋）逡逑系统参与自噬囊泡膜的延长，使其逐渐闭合形成具有双层膜结构的自噬体％。在逡逑Ａｔｇ８／ＬＣ３系统中，ＬＣ３在Ａｔｇ４催化下形成ＬＣ３邋Ｉ，ＬＣ３邋Ｉ在Ａｔｇ３和Ａｔｇ７作用下，逡逑与a愔�酰乙醇胺（Ｐｈｏｓｐｈａｔｉｄｙｌｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ，ＰＥ）结合形成邋ＬＣ３ＩＩ［３８】。ＬＣ３ＩＩ邋的逡逑数量与自噬体形成的程度有关，，常作为自噬体含量的标志蛋白［３８，３９］。新生成的自逡逑噬体依赖膜上的突触融合蛋白１７邋（Ｓｙｎｔａｘｉｎｌ７）、ＳＮＡＰ与溶酶体上的ＶＡＭＰ８逡逑附着蛋白结合完成自噬溶酶体的形成，随后自噬底物由溶酶体水解酶降解［４Ｑ〗。逡�

本文编号：2639818