丙烯酰胺染毒对大鼠脊髓前角运动神经元和坐骨神经及腓肠肌运动终板的影响

发布时间：2020-05-11 13:07

【摘要】：丙烯酰胺(Acrylamide,ACR)是一种公认的毒性物质,具有神经毒性、致癌性、基因毒性、生殖毒性和遗传毒性等。普通人群主要通过饮食摄入,职业人群可通过职业环境接触。ACR对人类和动物最主要的毒性作用是神经毒性作用,而对周围神经的毒性作用尤为明显。无论是实验动物还是在长期接触该物质的人群,都能导致其发生感觉和运动功能障碍,如骨骼肌无力、体重减轻、共济失调等症状。ACR主要作用于神经末梢,通过损害突触的传递而发挥神经毒性的作用。因此关注ACR对周围神经的损伤具有一定的现实意义。据研究显示,在ACR染毒后大鼠所出现的症状中,双后肢骨骼肌无力的表现尤为明显。坐骨神经作为下肢重要的的神经,对毒性作用最为敏感,同时腓肠肌受坐骨神经分支的支配,在后肢的运动中发挥着重要的作用,而腓肠肌运动终板(Motor endplate,MEP)是维持骨骼肌正常运动功能中至关重要的结构。坐骨神经又是由中枢神经系统(Central nervous system,CNS)的脊髓前角运动神经元的轴突所组成,其功能状态必然与神经元的功能状态密切相关。因此,本课题选取腓肠肌MEP、坐骨神经及其对应节段的脊髓(腰骶膨大段)进行研究,分别检测其组织形态结构及相关蛋白表达的改变,探讨ACR染毒所致大鼠骨骼肌无力可能的原因,为临床上ACR中毒后的治疗提供实验依据。方法:1.建立动物模型:SPF级成年雄性SD大鼠32只,随机分为对照组(0mg/kg)、低(9mg/kg)、中(18mg/kg)和高(36mg/kg)剂量组,每组8只,分组灌胃染毒ACR,共21天。期间隔天称量体重,调整给药量,并每周进行一次行为学检测(步态评分和着陆足张开距离测量),第22天取材,并对腓肠肌进行湿重的称量。2.检测ACR对大鼠脊髓前角运动神经元的毒性影响:利用HE染色观察大鼠脊髓前角运动神经元形态的变化;Nissl染色检测大鼠脊髓前角运动神经元尼氏体含量的变化;透射电镜观察大鼠脊髓前角运动神经元突触的超微结构的改变;IHC和WB检测大鼠脊髓前角运动神经元AchE、CGRP和GAP43的表达情况。3.检测ACR对大鼠坐骨神经的毒性影响:利用HE染色观察大鼠坐骨神经结构的改变;透射电镜观察大鼠坐骨神经髓鞘板层超微结构的改变;LFB染色观察大鼠坐骨神经髓鞘脂类含量的表达情况;IHC和WB检测大鼠坐骨神经MBP和MAG的表达情况。4.检测ACR对大鼠腓肠肌运动终板的毒性影响:通过HE染色观察大鼠肌纤维结构的改变;氯化金染色观察大鼠神经末梢及MEP形态数目的改变;乙酰胆碱酯酶染色检测腓肠肌运动终板乙酰胆碱酯酶含量的改变;IHC和WB检测大鼠腓肠肌AchE和CGRP的表达情况。结果:1.大鼠行为学的改变:ACR染毒后大鼠体重从第三周开始,增长速率与染毒剂量呈负相关,高剂量组大鼠体重开始下降,组间比较差异显著;步态评分结果显示,对照组始终为1分,而低、中、高剂量组的得分均有所增加,且呈剂量依赖性,从第二周开始组间比较差异明显;着陆足张开距离结果显示,从第二周开始,高剂量组与其它组比较均显著增宽(P0.01);从第三周开始,中剂量与对照组、低剂量组比较差异明显(P0.01),低剂量组与对照组比较也有所增宽(P0.01)。2.脊髓前角运动神经元的毒性改变:HE结果显示,ACR染毒后,运动神经元胞体分布稀疏,并出现萎缩、染色加深;染毒后中高剂量组尼氏染色范围变小(P0.01),染色变浅,细胞内尼氏小体零星分布,细胞体积变小;透射电镜结果显示,高剂量组脊髓前角的突触数目较少,结构不清晰,着色浅,突触小泡和突触间隙的递质均较少;IHC和WB检测发现,与对照组相比,低、中、高剂量组AchE、CGRP和GAP43的表达均有所减少,呈剂量依赖性,差异显著(P0.01)。3.坐骨神经的毒性改变:HE结果显示,ACR染毒后,低、中剂量组髓鞘呈现不同程度的肿胀,轴突结构发生改变;高剂量组神经纤维排列紊乱,髓鞘结构不清晰,轴突消失;透射电镜显示染毒后髓鞘板层有空洞形成,轴索变性,施旺细胞的细胞器溶解,有髓神经纤维之间有胶原纤维增生等现象;LFB髓鞘染色(伊红法)发现,染毒后髓鞘结构变薄变细,染色变浅且着色不均;IHC和WB检测发现,与对照组相比,各组MBP和MAG的表达均随染毒剂量增大而减少(P0.01)。4.腓肠肌运动终板的毒性改变:腓肠肌湿重结果显示,与对照组相比,中剂量组大鼠腓肠肌湿重明显降低(P0.05),高剂量组降低更为显著(P0.01);HE结果显示染毒后肌纤维结构变细,排列密集,且有细胞核聚集的现象,剂量越高越明显;氯化金染色显示染毒后末梢神经分支变少、变细,神经纤维结构变短、变稀疏,MEP结构较少,染色变浅,结构不清晰;乙酰胆碱酯酶染色(亚铁氰化铜法)显示染毒后大鼠MEP形态变小,分布稀疏,且呈剂量依赖性,相比对照组,低、中、高剂量组乙酰胆碱酯酶含量均显著降低(P0.01);IHC和WB检测发现,与对照组相比,低、中、高剂量组随染毒剂量增大,AchE和CGRP的表达逐渐减少(P0.01)。结论:1.ACR损伤了脊髓前角运动神经元的正常结构和功能,可能与ACR使AChE、CGRP和GAP43的含量下降,从而使脊髓前角运动神经元生长及再生的功能受损、轴突退变、突触结构受损致信号传递障碍有关。2.ACR染毒损伤了大鼠坐骨神经的正常结构和功能,这可能是与ACR染毒导致了轴索变性、MBP和MAG蛋白的表达量下降所致神经脱髓鞘相关。3.ACR染毒所致大鼠腓肠肌湿重下降、MEP结构改变,可能是ACR导致了轴索变性引起轴浆运输功能障碍,进而使神经肌肉接头处AChE和CGRP等功能蛋白的含量下降有关。4.ACR可能通过损伤脊髓前角运动神经元的胞体及轴突,使其合成、运输蛋白能力下降,同时使坐骨神经脱髓鞘,神经末梢信号传递减弱,最终导致MEP退变,肌肉萎缩致骨骼肌无力的发生。
【图文】：

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鼠全段的椎骨及脊髓，箭头所指为截取的腰骶brae and spinal cord of rats, arrow shows the tru制取 1080mg 的 ACR 晶体溶于 150ml 的mg/ml 的 ACR 原液。由于 SD 大鼠最用大鼠为 300-350g，故按大鼠体重（把原液进行不同程度稀释：高浓度=原液ddH2O 40ml（3.6mg/ml），低浓度=原鼠的灌胃体积（ml）=5*体重（kg），最mg/kg、18mg/kg、36mg/kg，对照组则灌50ml 的 0.9%生理盐水中加入 2g 水合氯1500ml 的 PBS 溶液中加入 60g 多聚甲加入少许 NaOH 搅拌至溶液澄清，再加避光保存。

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广东药科大学硕士研究生学位论文结果2.4.1 ACR 染毒对大鼠体重变化的影响结果显示大鼠的初始体重均在 300-350g，在染毒第一周，，各组大鼠体重增长幅度相同；染毒第二周，与对照组和低剂量组相比，中、高剂量组大鼠体重增长的速所下降，但尚无显著性差异（P>0.05）；染毒第三周开始，各组大鼠体重增长速染毒剂量呈负相关，且高剂量组大鼠体重开始下降，与各组进行比较，差异明显 2-2）。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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