食源性致病菌多重荧光定量PCR检测体系的建立

发布时间：2020-05-11 21:48

【摘要】：食品安全被视为一个全球性的公共卫生问题,食源性致病菌是食品安全的一个重要方面。本文以沙门氏菌、阪崎肠杆菌、副溶血弧菌、单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌五种食源性致病菌为供试菌株展开研究。建立了五个单重qPCR体系和一个三重qPCR体系,并围绕湖州市微生物制剂与农产品安全重点实验室自主研发的微生物分子检测仪,建立一种配套该仪器使用的单重荧光定量PCR自动化检测体系。并利用样本模拟实验、真实食品检测实验和传统方法验证等实验,确定上述各检测方法的可靠性。主要研究结果如下:1.本文参考的五种食源性致病菌引物和探针序列来自于SN/T 1870—2007,在优化了单重体系中探针浓度之后,建立了沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌和阪崎氏肠杆菌五种食源性致病菌的单重qPCR检测体系。经过人工模拟样本实验,未经增菌的人工模拟牛奶最低检测限为69copies/m L,人工模拟面包的最低检测限为37 copies/m L,同时这五种单重qPCR体系的变异系数为1.30%~3.89%。2.本研究随后建立了能同时检测沙门氏菌、单增李斯特菌和副溶血性弧菌的三重qPCR检测体系。经过面包样本模拟实验,利用该数据分析了沙门氏菌、单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌在该三重PCR检测体系的最低检测限分别达到了7 copies/m L,32 copies/m L和42 copies/m L;同时该三重检测体系的变异系数为0.52%~2.18%,表明检测系统的重复性良好。3.本研究利用单重qPCR检测方法检测14份食品样品;又利用三重qPCR检测方法检测了40份海鲜样品。结果表明,两种体系可以较准确的检出食品中的食源性致病菌。单重检测时,定量检测仅Db2检出沙门氏菌,而定性检测中,Db2、Da3和Xa2样品疑似检出沙门氏菌。三重检测的检出率为71.67%,国标方法的检出率为82.5%,三重qPCR检测方法中沙门氏菌的正确率为100%,副溶血弧菌检出的正确率为50%,单增李斯特菌检出的正确率为32%。本研究建立了三重qPCR检测方法和与微生物分子检测仪配套的检测技术体系,为食品中食源性致病菌的快速检测提供了参考。
【图文】：

探针,浓度,S型曲线

3.1 探针浓度优化在TAKARA公司试剂推荐的体系下，为了进一步确认最低探针浓度，故对其做优化实验。探针浓度安排在10 uM、5 uM、2.5 uM、1.25 uM，结果如图2-1。根据扩增曲线峰形可知，，当浓度为2.5 uM和1.25 uM时，扩增曲线呈S型曲线，而浓度在5 uM以上时，扩增曲线并不是严格意义上的S型曲线。故根据实验结果，探针的浓度为1.25 uM。图 2-1 探针浓度优化结果Fig 2-1 The optimizated results of probe concentration3.2 五种食源性致病菌的 qPCR 实验将沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、阪崎肠杆菌和副溶血弧菌的基因组DNA分别进行 10倍梯度稀释后，作为qPCR模板DNA，进行qPCR实验。以标准品稀释后对应的拷贝数为横坐标

标准曲线,标准曲线,沙门氏菌,梯度稀释

基因组DNA分别进行 10倍梯度稀释后，作为qPCR模板DNA，进行qPCR实验。以标准品稀释后对应的拷贝数为横坐标，Ct值作为纵坐标建立沙门氏菌qPCR标准曲线，结果如图2-2~2-6。
【学位授予单位】：浙江农林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R155.5

【参考文献】