CYP3A65代谢活化BDE47影响斑马鱼甲状腺激素稳态的机制研究

发布时间：2020-05-12 06:45

【摘要】：多溴联苯醚类(polybrominated diphenyl ethers,PBDEs)是广泛使用的溴代阻燃类化合物,具有半挥发性、高亲脂性和难降解性等特点。2,2’,4,4’-四溴联苯醚(2,2’,4,4’-tetrabromodiphenyl ether,BDE47)是人体血液和母乳样本中检测到的含量最为丰富的PBDEs同系物,因其在环境和人体中含量的显著增加而备受关注。人群资料研究表明,血浆中BDE47的浓度与甲状腺激素(Thyroid hormones,THs)水平呈负相关,提示BDE47具有甲状腺激素稳态干扰效应。也有研究表明,新生儿脐带血中BDE47的浓度与其出生体重呈负相关,提示发育早期暴露BDE47可能对胚胎发育造成损害。然而,BDE47干扰甲状腺激素稳态与发育毒性的关系尚不明确。此外,目前关于PBDEs干扰甲状腺激素稳态机制的研究多集中在对下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT轴)或者甲状腺激素受体(Thyroxine receptors,TRs)的研究,而对调控周围组织甲状腺激素的脱碘酶(Deiodinase,DIO)的研究相对较少。生物转化是外源化学物在体内发挥毒性的重要过程,主要由细胞色素P450酶(Cytochrome P450,CYP450)介导。课题组前期研究证实,BDE47能被CYP3A代谢生成一系列代谢产物,产生更强的生殖和发育毒性。但CYP3A介导的生物转化在BDE47干扰甲状腺激素稳态中的作用及其与发育毒效应的关系有待阐明。本研究运用野生型(WT)及cyp3a65敲除(KO)的斑马鱼模型,通过BDE47(1μM)经水体暴露染毒,旨在探究CYP3A65(与人CYP3A4同源)在BDE47致斑马鱼胚胎早期发育毒性中的作用及甲状腺激素稳态的干扰机制。第一部分:CYP3A65对BDE47干扰斑马鱼甲状腺激素稳态的影响及其与发育异常的关系目的:明确CYP3A65介导的生物转化在BDE47干扰斑马鱼甲状腺激素稳态中的作用及其与发育毒效应的关系。方法:通过Real-time PCR及WesternBlot方法,对TALEN技术构建的cyp3a65敲除的斑马鱼模型进行验证;基于野生型(WT)和cyp3a65敲除模型(KO)建立BDE47(1μM)经水体染毒模型,观察0-144 hpf斑马鱼胚胎的主要毒性终点指标,包括孵化率、畸形率、体长、眼及鱼鳔发育;通过对比BDE47处理下WT和KO组胚胎发育的表型差异,探究cyp3a65在BDE47所致斑马鱼胚胎发育异常中的作用;运用ELISA试剂盒检测144 hpf斑马鱼胚胎甲状腺激素水平,包括T3、T4、rT3、TSH,并通过Real-time PCR检测调节机体甲状腺激素代谢的脱碘酶(dio)表达量的变化,以初步探讨BDE47致斑马鱼甲状腺激素紊乱的机制。结果:与溶剂对照组相比,BDE47染毒野生型斑马鱼(BDE47/WT)胚胎在24-58hpf孵化延迟;在96 hpf,胚胎眼部发育减小,为7.0×10~4μm~2(对照组为8×10~4μm~2);在120 hpf,对照组的鱼鳔膨胀率达100%,而BDE47染毒导致鱼鳔膨胀率仅为86%;在144 hpf,BDE47染毒组胚胎体长明显减小,为3.6×10~3μm(对照组为3.8×10~3μm),且畸形率高达70%,以脊柱背向弯曲为主,而对照组几乎无畸形。敲除cyp3a65后,暴露于BDE47的斑马鱼(BDE47/KO)胚胎的孵化率始终高于BDE47/WT组,96 hpf的眼部大小(7.7×10~4μm~2)、120 hpf的鱼鳔膨胀率(94%)及144 hpf的体长(3.7×10~3μm)和畸形率(58%)均明显改善。此外,与对照组相比,BDE47/WT组斑马鱼Ⅰ型脱碘酶(dio1)和Ⅱ型脱碘酶(dio2)的表达无明显变化,而Ⅲ型脱碘酶(dio3a、dio3b)的表达明显升高,同时伴随甲状腺激素T3水平的显著降低,rT3显著升高,但T4和TSH无明显改变。进一步分析发现,T3/T4的比值显著降低。敲除cyp3a65后,斑马鱼三种类型脱碘酶的表达均与对照组无异,甲状腺激素T3、rT3水平及T3/T4比值也显著改善。第二部分:CYP3A65对BDE47的代谢活化作用及其影响斑马鱼甲状腺激素稳态的机制目的:分析BDE47在斑马鱼体内的代谢,探讨CYP3A65对BDE47的生物转化作用及其影响甲状腺激素稳态的分子机制。方法:利用已建立的BDE47染毒的野生型(WT)和cyp3a65敲除的(KO)斑马鱼胚胎模型,运用UPLC-MS/MS和GC-MS/MS检测144 hpf体内BDE47活性代谢产物的含量,分析CYP3A65在代谢BDE47生成活性产物中的作用;用所测得的代谢产物染毒野生型斑马鱼胚胎至144 hpf,分析代谢产物的储留程度及相互转化关系;用所测得的代谢产物分别染毒WT和KO斑马鱼胚胎至144hpf,通过Real-time PCR检测其对Ⅲ型脱碘酶(dio3a、dio3b)表达的影响,分析BDE47经CYP3A65代谢后干扰dio3表达的主要代谢产物。结果:BDE47可在斑马鱼胚胎体内被代谢生成3-OH-BDE47、5-OH-BDE47、6-OH-BDE47、3-MeO-BDE47、5-MeO-BDE47、6-MeO-BDE47六种产物,且羟基化代谢产物(OH-BDE47)的含量整体高于甲氧基代谢产物(MeO-BDE47)的含量;BDE47/WT组斑马鱼体内OH-BDE47及MeO-BDE47的含量均高于BDE47/KO组,提示CYP3A65可能是斑马鱼体内BDE47的代谢酶;六种代谢产物在斑马鱼体内均有一定的储留,且除了5-OH-BDE47只能向5-MeO-BDE47单向转化外,3-OH-BDE47与3-MeO-BDE47之间、6-OH-BDE47与6-MeO-BDE47可存在相互转化的关系;进一步分析发现,仅3-MeO-BDE47能显著上调WT及KO组斑马鱼dio3a、dio3b的表达,其余几种代谢产物对dio3表达无明显影响,推测3-MeO-BDE47是BDE47经CYP3A65代谢干扰斑马鱼dio3表达的关键活性产物。综合上述结果,我们推测3-MeO-BDE47可能是BDE47经CYP3A65代谢后上调dio3的主要活性产物。结论本研究基于野生型(WT)和cyp3a65敲除(KO)斑马鱼染毒模型,初步阐明了CYP3A65在BDE47干扰斑马鱼甲状腺激素稳态中的作用及其与发育异常的关系,从生物转化的角度探讨了BDE47经CYP3A65代谢后的主要活性产物及其对斑马鱼甲状腺激素稳态的干扰机制,获得了如下结论:1.BDE47可导致斑马鱼早期发育异常,敲除cyp3a65能明显改善BDE47对斑马鱼胚胎发育的损伤作用;此外,BDE47可引起斑马鱼甲状腺激素紊乱,敲除cyp3a65能明显改善BDE47对甲状腺激素水平的影响,提示BDE47对甲状腺激素稳态的干扰作用可能参与了斑马鱼早期发育过程,且CYP3A65在其中发挥了重要作用。2.斑马鱼CYP3A65是BDE47的主要代谢酶,所生成的六种代谢产物在斑马鱼体内均有一定的储留,且除了5-OH-BDE47只能向5-MeO-BDE47单向转化外,其余OH-BDE47与MeO-BDE47可存在对应的相互转化的关系。3.3-MeO-BDE47是上调斑马鱼dio3表达的关键活性产物,提示3-MeO-BDE47可能是CYP3A65代谢BDE47导致斑马鱼甲状腺激素稳态异常的主要活性代谢产物。
【图文】：

12T3,而DIO3主要脱内环碘催化T4形成非活性rT3；T3内环脱碘和rT3外环脱碘均可形成T2,进而排出体外（图1）[22]。图1 脱碘酶对甲状腺激素的调节PBDEs对脱碘酶活性和表达的影响是其导致THs紊乱的重要机制之一[23]。有报道称，dio1、dio2和dio3被作为研究大鼠和其他生物（包括鱼类）甲状腺激素稳态的生物标志物[24]。许多研究表明，环境剂量下的PBDEs可对dio1、dio2和dio3的转录水平产生显著影响[13, 23]。例如，斑马鱼胚胎暴露于0.625 ppm 的BDE-47到28 hpf 后，dio1和dio2的转录水平显著上调[25]。BDE-99和BDE-209暴露均可导致人肝细胞中dio1的mRNA上调[26]。此外，体外代谢研究也表明OH-BDEs对人体肝组织中的DIO1酶活性有显著抑制作用[27]。由此可见，PBDEs可能通过影响脱碘酶的表达从而产生甲状腺激素稳态的干扰作用。生物转化是指外源化学物在机体内经多种酶催化的代谢转化，，是机体对外源化学物处置的重要过程。这一过程或者代谢解毒

analysis of variance）法对组间进行统计学差异分析。当 P ＜ 0.05 时，认为差异有统计学意义，用 Graphpad Prism 6 软件作图。结果一、cyp3a65 基因在 WT 和 KO 斑马鱼中的表达为了鉴定 cyp3a65 敲除斑马鱼胚胎模型，本研究运用 Real-time PCR 检测cyp3a65 在斑马鱼 144 hpf 的转录水平，并采用 Western Blot 进一步验证其表达水平。实验结果如图 2 所示，cyp3a65 在对照组斑马鱼（DMSO/WT）体内有一定的表达，BDE47 染毒可诱导野生型斑马鱼 cyp3a65 的表达；在 cyp3a65 敲除斑马鱼（DMSO/KO）体内几乎没有表达，BDE47 对 cyp3a65 敲除后的斑马鱼也失去了诱导作用。由此可见，本实验室前期构建的 cyp3a65 敲除斑马鱼模型较为成功，可用于后续实验。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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本文编号：2659831