孕期双酚A暴露对子代雄性大鼠生殖系统的影响及miRNA调控机制研究

发布时间：2020-05-15 10:53

【摘要】：目的双酚A(Bisphenol A,BPA)作为环境内分泌干扰物的一种,主要应用于工业和日用品生产中,可通过消化道、呼吸道及皮肤等接触途径进入机体,并对人和动物产生一定的危害作用。由于其具有弱雌激素样和强抗雄激素样作用,可对雄性生殖系统产生影响,但目前其损伤机制尚不清楚。因此,本研究利用生命早期环境暴露剂量下BPA的动物染毒模型,采用microRNA芯片技术及生物信息学方法进行差异基因及信号通路的预测,并通过基因表达水平、蛋白水平检测、形态学分析等方法分别对差异表达的microRNA(miRNA)、性激素水平及超微结构、形态学等方面进行分析及验证,以阐明生命早期BPA暴露对生殖系统损伤的表观遗传学miRNA调控的机制,为BPA雄性损伤的早期生物指标检测及防治提供理论依据。方法1.SPF级1 0周龄健康SD大鼠,其中雄性大鼠30只,雌性大鼠60只。按雌雄比为2:1进行合笼,于次日晨进行阴道涂片法检测,检到精子者记为孕0天(GD0),每日记录雄鼠交配情况,以避免父源性因素导致的个体差异保证其均衡性。将受孕母鼠随机分为五个剂量组,于GD5进行灌胃染毒,染毒剂量分别为0、0.05、0.5、5、50 mg/kg,以5 ml/kg容积灌胃染毒至GD19,1次/天,分别在GD20、出生后(PND)21及PND56三个阶段处理仔鼠。2.观察孕期暴露BPA对GD20的胎鼠的一般毒性情况及胎鼠雌雄比例情况的影响。3.将GD20阶段的仔鼠睾丸进行microRNA芯片分析并对GD20、PND21、PND56的仔鼠睾丸的miRNA差异表达情况进行Real-time PCR验证,通过GO分析及Pathway分析对其影响的毒作用信号通路进行预测分析。4.观察PND56阶段仔鼠的精子总数、体重及各脏器系数的影响;通过HE染色及透射电镜对睾丸组织的损伤情况及细微结构损伤情况进行观察;通过ELISA法测定卵泡刺激素(FSH)、黄体生成素(LH)、睾酮(T)三种性激素水平的表达情况。结果一、孕期BPA暴露对GD20雄性胎鼠一般毒性情况及miRNA表达谱的影响1.对GD20阶段的胎鼠一般毒性情况及雌雄比分析发现,与对照组比较,孕期暴露BPA对胎鼠的含羊水总重产生一定程度的下降趋势,但仅在剂量为5 mg/kg时该影响具有统计学意义(P0.05)。从结果上看,孕期暴露BPA并不影响孕鼠胎盘的重量。但能一定程度造成胎鼠的低体重出生情况,在剂量为0.5、5和50 mg/kg时,下降具有统计学意义(P0.05)。然而在雌雄比例上并无明显差异(P0.05)。2.通过对GD20阶段的microRNA芯片结果分析发现,与对照组比较,5mg/kg剂量组出现133个miRNA上调及136个miRNA下调,0.05mg/kg剂量组出现171个miRNA上调及1 24个miRNA下调;通过表达量及差异表达倍数交联筛选出26个miRNA进行Real-time PCR进行验证发现miR-361-5 和miR-19b-2-5p在0.05及5 mg/kg剂量组出现上调而miR-203a-3p在5mg/kg剂量组出现下调且差异具有统计学意义(P0.05);通过TargetScan数据库进行靶基因预测并通过Pathway分析发现排在前三位的预测信号通路为Choline metabolism in cancer、MicroRNAs in caner及GABA信号通路。二、孕期BPA暴露的雄性仔鼠生长发育过程中差异表达miRNA的改变情况1.运用Real-time PCR法对PND21阶段的仔鼠睾丸26种miRNA表达情况进行验证,PND21,miR-409b在0.05 mg/kg及5 mg/kg剂量组表达发生上调而miR-30b-3p在5 mg/kg剂量组表达发生上调且差异具有统计学意义(P0.05);2.运用Real-time PCR对PND56阶段的仔鼠睾丸26种miRNA表达情况进行验证,从结果上看,5 mg/kg剂量组与对照组比较,miR-203a-5p、miR-19b-2-5p、miR-671、miR-409b和miR-30b-3p出现相对表达量升高且差异具有统计学意义(P0.05)。而在0.05 mg/kg剂量组与对照组比较中,除miR-203a-5p、miR-19b-2-5p、miR-671、miR-409b和miR-30b-3p相对表达量出现相应升高外,miR-41 0-5p及miR-203a-3p也出现了增高,且差异具有统计学意义(P0.05)。三、孕期BPA暴露对子代雄性大鼠生殖损伤情况的影响1.在PND56阶段5和50 mg/kg组的子代雄鼠体重显著高于对照组(P0.05);睾丸及肾脏的脏器系数不同剂量组均出现不同程度的下降,但没有统计学意义,仅肝脏系数在0.5、50 mg/kg剂量组显著高于对照组(P0.05);与对照组比较,精子总数各剂量组均出现不同程度的降低且在0.05、0.5及5 mg/kg剂量组具有统计学意义(P0.05)。2.对三种性激素含量水平检测发现,与对照组比较,FSH、LH、T在各染毒剂量组均出现降低,而LH和T在0.051mg/kg下降具有统计学意义(P0.05),而FSH在50 mg/kg下降具有统计学意义(P0.05)。3.HE染色在0.05 mg/kg剂量组可以看到曲细精管出现轻微萎缩,部分生精细胞消失。剂量在0.5 mg/kg时曲细精管萎缩,生精细胞层数变薄,精子生成减少。剂量为5 mg/kg时生精细胞排列出现紊乱萎缩,层数发生改变,精子生成减少。当剂量达到50 mg/kg时,睾丸镜下可见大量多核巨细胞,但并未出现曲细精管萎缩现象,精子生成有一定程度减少。从睾丸电镜下的超微结构上看,线粒体在0.05、0.5 mg/kg剂量组未见明显异常改变;而当剂量上升到5 mg/kg时,镜下可见线粒体出现断脊、空泡样改变。将剂量为50 mg/kg时,线粒体变化更为显著,大部分均出现线粒体肿胀、断脊、空泡样改变。结论1.孕期暴露低剂量BPA能够导致子代雄鼠出现精子总数下降、性激素水平异常及睾丸组织损伤;2.孕期暴露低剂量BPA能够导致子代雄鼠睾丸的miRNA表达情况发生改变,且这种改变随着生长发育出现不同程度的改变;3.通过miRNA芯片技术及生物信息学预测获得,孕期暴露低剂量BPA产生生殖毒性的miRNA调控机制可能为:Choline metabolism in cancer、MicroRNAs in caner、GABA信号通路、Phosphatidylinostol信号通路、Morphine addiction、FoxO信号通路、Pancreatic secretion、Signaling pathways regulating pluripotency、VEGF信号通路和Retrograde endocannabinoid信号通路,但具体调控机制仍需进一步的验证。
【图文】：

们选择差异倍数为２倍作为本研宄的筛选指标。在５邋ｍｇ／ｋｇ组中，我们发现与对逡逑照组相比，１３３个ｍｉＲＮＡ上调，１３６个ｍｉＲＮＡ下调。随后我们还发现，，与对照逡逑组相比，０．０５ｍｇ／ｋｇ组有１７１个ｍｉＲＮＡ上调，１２４个ｍｉＲＮＡ下调。详见图１和表逡逑４0逡逑２２逡逑

由于芯片筛选的ｍｉＲＮＡ数目过多，本研究不可能完成全部验证，因此，本研逡逑究通过将５ｍｇ／ｋｇ与对照组比较ｍｉＲＮＡ表达量（平均值＞５００）和差异表达倍数（差逡逑异倍数＞２）双重交联后筛选出本研宄目的ｍｉＲＮＡ，己开展下一步研宄，详见
【学位授予单位】：沈阳医学院
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114

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