钙离子诱导内质网应激在小鼠肺成纤维细胞凋亡中的作用

发布时间：2017-03-26 12:04

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【摘要】：目的探讨小鼠肺成纤维细胞内钙稳态失衡时Ⅰ型胶原蛋白的表达以及肺成纤维细胞凋亡情况,本研究使用钙离子拮抗剂-粉防己碱(Tetrandrine,Tet)和肌浆网钙泵抑制剂-毒胡萝卜素(Thapsigargin,TG)体外作用小鼠肺成纤维细胞,观察钙离子(Ca2+)失衡时,内质网应激(Endoplasmic reticulum stress,ERS)指标和细胞凋亡情况,从ERS途径探讨细胞凋亡信号通路,阐明Ca2+、ERS、细胞凋亡的作用机理,为临床上防治肺纤维化疾病提供理论依据。方法液氮冻存的小鼠肺成纤维细胞,放入37℃恒温水浴箱内进行融化,快速接种于刚配置好的完全培养基内,放置于5%CO2、37℃恒温孵育箱内,定期通过倒置相差显微镜观察培养瓶内细胞生长情况,经常规的换液、传代培养和同步化。根据MTT检测结果将细胞分为4组,即对照组、转化生长因子-β1(TGF-β1)组、钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组。对照组细胞给予完全培养基,其他3组给予5ng/ml TGF-β1作用24h后,钙离子拮抗剂组和肌浆网钙泵抑制剂组再分别给予5mg/l Tet和4μM TG作用细胞24h。进行扫描电子显微镜观察细胞形态、流式细胞仪检测各组细胞凋亡率和细胞周期比例、激光共聚焦显微镜观察各组细胞内Ca2+水平、Western-blot方法检测Ⅰ型胶原、GRP78、Calpain-2、CHOP,免疫组织细胞化学方法检测caspase-12、caspase-3蛋白表达。结果1细胞形态对照组和TGF-β1组在扫描电子显微镜下观察,细胞膜、细胞核、染色质形态完整,加入钙离子拮抗剂、肌浆网钙泵抑制剂的两组细胞均出现了典型的凋亡形态:细胞浆浓缩、细胞体积缩小、染色质逐渐聚集呈月牙形等。2细胞周期各组间,G1期、S期、G2期变化均有显著性差异(P0.05);与对照组相比较,加入TGF-β1作用后的细胞的G1期细胞比例降低(P0.05),S期细胞比例明显增加(P0.05),G2期细胞比例下降(P0.05);与TGF-β1组相比较,加入钙离子拮抗剂、肌浆网钙泵抑制剂作用后的细胞,G2期和S期细胞比例均明显减少(P0.05),G1期比例均明显增加(P0.05);3细胞凋亡流式细胞仪检测结果发现,对照组、TGF-β1组、钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组的凋亡率分别为6.73%、5.03%、9.60%、21.53%,各组间比较差异显著(P0.05);钙离子拮抗剂组和肌浆网钙泵抑制剂组凋亡率明显高于对照组和TGF-β1组。4 Ca2+浓度各组间比较差异显著(P0.05);与对照组相比较,TGF-β1组细胞内荧光度值变化不明显(P0.05);与TGF-β1组相比较,加入钙离子拮抗剂后,细胞内的荧光度值明显降低,差异具有统计学意义(P0.05),但加入肌浆网钙泵抑制剂后,细胞内荧光度值明显升高(P0.05);5 Western-blot检测结果各组间成纤维细胞内Ⅰ型胶原蛋白、GRP78、CHOP和Calpain-2蛋白的表达均有显著性差异(P0.05);TGF-β1组的Ⅰ型胶原蛋白表达明显高于对照组(P0.05),但钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组两组的Ⅰ型胶原蛋白表达显著降低对照组和TGF-β1组(P0.05)。与对照组相比,TGF-β1组的GRP78和CHOP蛋白表达差异不明显(P0.05),而钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组两组GRP78和CHOP蛋白表达明显高于对照组和TGF-β1组(P0.05)。与对照组相比,TGF-β1组和钙离子拮抗剂组的Calpain-2蛋白表达差异不明显(P0.05),肌浆网钙泵抑制剂组Calpain-2蛋白表达明显升高(P0.05),而钙离子拮抗剂组的Calpain-2蛋白表达与TGF-β1组比较差异不明显(P0.05),肌浆网钙泵抑制剂组Calpain-2蛋白表达明显升高(P0.05);6免疫细胞组织化学检测结果各组间成纤维细胞内caspase-12、caspase-3蛋白表达均有显著性差异(P0.05);与对照组相比,TGF-β1组的caspase-12、caspase-3蛋白表达差异不明显(P0.05),钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组两组caspase-12、caspase-3蛋白表达明显升高(P0.05),与TGF-β1组比较,钙离子拮抗剂组、肌浆网钙泵抑制剂组两组caspase-12、caspase-3蛋白表达均明显升高(P0.05)。结论1钙离子拮抗剂和肌浆网钙泵抑制剂能改变成纤维细胞周期分布,促进成纤维细胞凋亡。2钙离子拮抗剂和肌浆网钙泵抑制剂可使肺成纤维细胞内Ca2+稳态失衡,诱导ERS,通过ERS凋亡途径促进细胞凋亡,可以阻止肺纤维化进程
【关键词】：钙离子 内质网应激 肺成纤维细胞 细胞凋亡
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R135.2
【目录】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 英文缩略表10-11
• 引言11-13
• 第1章 实验研究13-41
• 1.1 材料与方法13-22
• 1.1.1 细胞系13
• 1.1.2 主要试剂、试剂盒名称及来源13-14
• 1.1.3 常用实验试剂和溶液的配置14-15
• 1.1.4 主要仪器设备15-16
• 1.1.5 成纤维细胞常规培养16
• 1.1.6 MTT比色法筛选钙离子拮抗剂、肌浆网钙泵抑制剂干预剂量和时间16
• 1.1.7 实验分组16-17
• 1.1.8 扫描电镜观察L929细胞形态17
• 1.1.9 流式细胞仪检测L929细胞周期17
• 1.1.10 流式细胞仪检测细胞凋亡17-18
• 1.1.11 激光共聚焦显微镜检测各组细胞钙离子的浓度18
• 1.1.12 Western-blot方法检测成纤维细胞内GRP78、CHOP、calpain-2和Ⅰ型胶原蛋白表达情况18-21
• 1.1.13 免疫细胞化学检测各组成纤维细胞内caspase-12、caspase-3 蛋白表达21-22
• 1.1.14 统计学数据分析22
• 1.2 结果22-35
• 1.2.1 钙离子拮抗剂和肌浆网钙泵抑制剂作用剂量和时间22-24
• 1.2.2 小鼠肺成纤维细胞培养形态观察24-25
• 1.2.3 流式细胞仪检测细胞周期结果25-27
• 1.2.4 钙离子拮抗剂、肌浆网钙泵抑制剂对成纤维细胞凋亡的影响27-28
• 1.2.5 激光共聚焦电子显微镜检测钙离子28-29
• 1.2.6 Western-blot方法检测细胞内GRP78、CHOP、calpain-2 和Ⅰ型胶原蛋白表达29-32
• 1.2.7 免疫细胞组织化学检测细胞内caspase-12、caspase-3 蛋白表达结果32-35
• 1.3 讨论35-38
• 1.3.1 处理因素的选择35
• 1.3.2 细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的变化35-36
• 1.3.3 细胞内钙离子、内质网应激指标变化36-37
• 1.3.4 抗纤维化作用37-38
• 1.4 结论38-39
• 参考文献39-41
• 第2章 综述 内质网应激与肺纤维化的研究进展41-50
• 2.1 内质网应激与成纤维细胞41
• 2.2 内质网应激发生条件及分类41-42
• 2.3 内质网应激信号通路42-43
• 2.4 内质网应激与细胞凋亡43-45
• 2.5 内质网中钙的作用45
• 2.6 内质网与肺纤维化45-46
• 参考文献46-50
• 结论50-51
• 致谢51-52
• 导师简介52-53
• 作者简介53-54
• 学位论文数据集54

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本文编号：268761