红色荧光蛋白标记的鼠李糖乳样菌在小鼠肠道内运动及定植情况研究

发布时间：2017-03-26 20:09

  本文关键词：红色荧光蛋白标记的鼠李糖乳样菌在小鼠肠道内运动及定植情况研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：随着人们对饮食及健康之间关系的日益关注,研究和开发出健康和功能性食品已经成为目前食品科学研究的一个重要趋势。据报道,摄入益生菌会调节肠道菌群,增强宿主的免疫力。益生菌发挥其有益作用的前提是可以顺利通过消化道并黏附或定植在肠道粘液或上皮细胞。这需要该菌株具有对胃液中酸性环境的耐受性及对小肠中胆盐的抵抗力。鼠李糖乳杆菌是分离自健康人体肠道,现已被世界所了解,属于第三代益生菌。该菌株的优势主要表现在对胆汁和胃酸的耐受性,能在人体内长时间定殖及较稳定的存在于乳制品中。鉴于鼠李糖乳杆菌的重要益生作用与特点,对其在肠道内定植机理的研究显得至关重要。而低聚糖作为研究较多益生元,是公认的双歧因子,它不能被宿主吸收消化和被病原菌利用,仅能被益生菌利用,因此低聚糖类可促进益生菌大量繁殖,增强益生菌的竞争优势。本试验以低聚糖类益生元为试验材料,鼠李糖乳杆菌05-28为受试菌株,首先用红色荧光蛋白dsred2标记鼠李糖乳杆菌05-28,将该重组菌株灌胃小鼠,观察该菌在小鼠肠道各部位定植规律,然后在体外筛选出对重组鼠李糖乳杆菌增殖能力较强的低聚糖,进一步研究低聚糖在小鼠体内对重组菌株的影响。本研究首先将重组质粒p MG36e-dsred2电转化到鼠李糖乳杆菌05-28后,经过菌液PCR及提取质粒验证,质粒p MG36e-dsred2成功转入试验菌株中。用荧光显微镜观察重组鼠李糖乳杆菌可看到明显红色荧光,dsred2基因在受试菌株中表达。随后检测鼠李糖乳杆菌05-28及重组鼠李糖乳杆菌对人工胃液胃肠液的耐受能力。经人工胃肠液消化后两株菌存活率均无明显差异。可用重组鼠李糖乳杆菌进行后续小鼠肠道内定植情况的探究试验。将重组鼠李乳杆菌灌胃BALB/c小鼠,取其各肠道制作石蜡切片,利用荧光显微镜观察重组菌株在小鼠肠道黏附情况,图片显示重组菌株能黏附于小鼠肠道绒毛。然后检测其在肠道内的定植规律,在口服3 h后小鼠肠道各部位均能检测到重组菌株,4天后达到定植的高峰,第7天留在小鼠肠道粘膜表面的重组菌株十二指肠占第1天的14.10%、空肠为14.35%、回肠为36.01%、结肠为27.3%,第15天小鼠各肠道均未检测到重组菌株,定植规律为回肠结肠空场十二指肠。本试验采用比浊法研究了低聚果糖、低聚木糖、低聚异麦芽糖及菊粉在体外对重组鼠李糖乳杆菌生长情况的影响。筛选出两种对重组菌株具有较好的增菌作用的低聚糖。即低聚果糖在添加量为2.4%,低聚木糖添加量为1.2%时,对重组菌株增值效果最好。因此,进一步研究低聚果糖及低聚木糖在小鼠肠道内对重组菌株的影响。将BALB/c雄性小鼠随机分为7组,对照组给予的重组菌及PBS,试验组分别给予重组菌及低、中、高剂量的低聚果糖及低聚木糖,连续给予14天。在连续给予小鼠低聚果糖7天后,与对照组相比低、中、高剂量组重组菌的数量均无明显变化。连续给予14天除低剂量组无明显变化外,中、高剂量组均能显著的增殖重组鼠李糖乳杆菌。连续灌胃小鼠低聚木糖7天,与对照组相比低、中剂量组重组鼠李糖乳杆菌的数量无明显变化,高剂量组有明显增加。连续灌胃14天低、中、高剂量组均能显著的增殖重组鼠李糖乳杆菌,但中、高剂量组无明显差异。停止灌胃后16天各肠道仍能检测到少量重组菌株。且结肠最多,回肠次之,十二指肠最少,说明低聚糖主要作用在回肠及结肠部位。本研究在探索鼠李乳杆菌在肠道内定植的基础上,研究了益生元与重组菌株定植能力的关系,加深了对该菌的了解,为其进一步的应用奠定了基础。
【关键词】：鼠李糖乳杆菌 红色荧光蛋白 定植 低聚果糖 低聚木糖
【学位授予单位】：河北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R151
【目录】：

• 中文摘要4-6
• abstract6-10
• 1 引言10-19
• 1.1 益生菌10-12
• 1.1.1 益生菌的来源和分类10
• 1.1.2 益生菌应具备的条件10
• 1.1.3 益生菌对人体的生理功能10-12
• 1.1.4 益生菌制品的发展现状及存在问题12
• 1.2 鼠李糖乳杆菌12-13
• 1.2.1 鼠李糖乳杆菌简介12-13
• 1.2.2 鼠李糖乳杆菌的研究现状13
• 1.3 红色荧光蛋白的研究进展13-16
• 1.3.1 红色荧光蛋白的理化性质14
• 1.3.2 红色荧光蛋白的优缺点14-15
• 1.3.3 红色荧光蛋白的修饰改进15
• 1.3.4 红色荧光蛋白的应用15-16
• 1.4 益生元16-17
• 1.4.1 益生元的概念及物化特性16
• 1.4.2 益生元的生理功能16-17
• 1.4.3 益生元应用现状17
• 1.5 课题研究的意义及内容17-19
• 1.5.1 研究意义17-18
• 1.5.2 课题研究基本内容18-19
• 2 材料与方法19-29
• 2.1 菌株及质粒19
• 2.2 益生元19
• 2.3 培养基及缓冲液19-20
• 2.3.1 培养基19
• 2.3.2 缓冲液19-20
• 2.4 主要试验试剂20
• 2.5 主要仪器设备20-21
• 2.6 试验试剂及药品的配制21-22
• 2.7 试验方法22-29
• 2.7.1 提取大肠杆菌DH5α 中质粒pMG36e-dsred2 及定量检测22-23
• 2.7.2 筛选转化子的红霉素浓度的确定23
• 2.7.3 鼠李糖乳杆菌 05-28 原生质体的制备及电击转化23-24
• 2.7.4 阳性转化子的筛选24-25
• 2.7.5 菌株体外耐受性检测25
• 2.7.6 菌株体外黏附性检测25-26
• 2.7.7 重组鼠李糖乳杆菌在小鼠肠道内定植情况研究26-27
• 2.7.8 益生元对重组鼠李糖乳杆菌体外生长的影响27
• 2.7.9 益生元对重组鼠李糖乳杆菌定植的影响27-29
• 3 结果与分析29-44
• 3.1 转化子鉴定29-31
• 3.1.1 转化子PCR鉴定29
• 3.1.2 乳酸菌提取质粒鉴定29-30
• 3.1.3 pMG36e-dsred2 在鼠李糖乳杆菌 05-28 中表达30-31
• 3.2 菌株外耐受性检测结果31-32
• 3.3 菌株外黏附性检测结果32-33
• 3.4 重组鼠李糖乳杆菌在小鼠肠道内定植及黏附情况研究33-37
• 3.4.1 重组鼠李糖乳杆菌在小鼠肠道内黏附情况33-34
• 3.4.2 重组鼠李糖乳杆菌在小鼠肠道内定植情况34-37
• 3.5 不同益生元对重组鼠李糖乳杆菌体外生长的影响37-39
• 3.5.1 重组鼠李糖乳杆菌在MRS及基础培养基中生长曲线测定37
• 3.5.2 四种益生元对重组鼠李糖乳杆菌体外生长的影响37-39
• 3.6 低聚果糖及低聚木糖对小鼠肠道内重组鼠李糖乳杆菌的影响39-44
• 3.6.1 不同剂量的低聚果糖对小鼠肠道不同部位重组鼠李糖乳杆菌的影响39-41
• 3.6.2 不同剂量的低聚木糖对小鼠肠道不同部位重组鼠李糖乳杆菌的影响41-44
• 4 讨论44-47
• 4.1 体外耐受人工胃肠液能力与菌株肠道内定植能力的关系44
• 4.2 体外黏附性与菌株肠道内定植能力的关系44
• 4.3 重组鼠李糖乳杆菌在小鼠肠道内定植44-45
• 4.4 益生元对重组鼠李糖乳杆菌体外生长的影响45
• 4.5 益生元对重组鼠李糖乳杆菌的影响45-47
• 5 结论47-48
• 参考文献48-53
• 在校期间发表的学术论文53-54
• 作者简介54-55
• 致谢55-56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前1条

1 李军训;罗学刚;高洁;郝冉;张同存;;益生菌的分类、生理功能与有效性评价研究进展[J];中国农业科技导报;2010年06期

  本文关键词：红色荧光蛋白标记的鼠李糖乳样菌在小鼠肠道内运动及定植情况研究，，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：269305