邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯促进氧化应激和炎症反应加重大鼠肝纤维化

发布时间：2020-06-05 07:49

【摘要】：邻苯二甲酸二(2-乙基)己酯(Di(2-ethylhexyl)phthalate,DEHP)是一种增塑剂,被广泛添加到聚氯乙烯中以增加其柔韧性,在多种产品中都有DEHP的使用,如医药用塑料软管、食品包装袋以及化妆品等。有研究表明,DEHP及其代谢产物会对心脏、肝脏、肾脏和生殖系统造成损害。肝纤维化是一种反复损伤和愈合的慢性肝损伤过程,包括感染性疾病、毒素暴露、代谢紊乱以及自身免疫性疾病等多种因素影响,已经成为了世界性的临床问题。肝纤维化是以细胞外基质(Extracellular matrix,ECM)过度沉积为主要病理特征。肝星状细胞(Hepatic stellate cells,HSCs)是产生ECM的重要来源,HSCs在受到激活后会转化为肌成纤维细胞,引起ECM合成和降解的失衡,从而造成ECM过度沉积。肝纤维化如果不加以防治,可进一步恶化成肝硬化甚至肝癌。流行病学研究表明,每日大量摄入邻苯二甲酸盐污染的食品可能是导致肝功能不全的危险因素之一。长期接触DEHP会影响肝脏疾病,并加剧慢性肝损伤的进展。然而,DEHP对肝纤维化的影响尚不清楚。在本研究中,我们探讨了DEHP对四氯化碳(CCl4)诱导的肝纤维化的影响,并进一步揭示其分子机制。研究目的:明确DEHP对肝纤维化大鼠病理损伤加重过程的影响,揭示TGF-β/Smad和p38MAPK/NF-κB信号通路在肝纤维化过程中的作用。研究方法:体内实验中,利用CCl4皮下注射诱导肝纤维化的模型,造模的同时给予灌胃DEHP(0.05,5,500 mg/kg),以及单独灌胃DEHP 500mg/kg作为对照;九周后处死大鼠,HE染色和MASSON染色观察DEHP对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏病理损伤状况;试剂盒检测血清中天门冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)和肝组织匀浆中丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)以及还原性谷胱甘肽(GSH)的含量;ELISA法检测血清中肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)水平;Western blot法检测α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表达。在体外细胞实验中,设置五组:正常组,TGF-β1,TGF-β1+DEHP(6.25,25,100μmol/L),体外培养24h后,CCK-8检测DEHP对LX-2细胞增殖的影响,DCFH-DA探针检测DEHP对LX-2细胞ROS的产生,Western blot法检测α-SMA、COL-Ⅰ、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表达。研究结果:1.DEHP暴露对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的病理损伤过程的影响HE染色检查表明,与正常组相比,CCl4组肝脏组织出现大量脂肪空泡、肝细胞坏死以及炎性细胞浸润。DEHP暴露可显著加重CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏病理的损伤,DEHP(5和500 mg/kg)组肝组织切片可见细胞坏死,脂肪变性以及炎症浸润明显加重;MASSON染色检查发现,与正常组相比,CCl4组肝脏血管壁周围存在明显的胶原沉积,且有少量的纤维间隔出现,DEHP暴露可显著促进CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏中胶原的沉积,从轻度的纤维化和脂肪变性转变成重度纤维化和大量的胶原纤维间隔,尤其在DEHP 500mg/kg剂量暴露组胶原沉积最为明显。在检测血清中转氨酶水平发现,与正常组相比,CCl4组血清中AST和ALT的水平明显升高,DEHP 500mg/kg剂量暴露后显著提高CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清中AST和ALT的水平。提示DEHP可显著加重CCl4诱导的肝纤维化大鼠的肝脏病理损伤。2.DEHP暴露对CCl4诱导的肝纤维化大鼠血清中炎症因子肿瘤坏死因子(TNF-α)和白介素6(IL-6)水平的影响与正常组相比,CCl4能显著大鼠血清中TNF-α和IL-6水平;与CCl4组相比,中高剂量DEHP(5,500 mg/kg)暴露能显著促进大鼠血清中TNF-α水平,而血清中IL-6水平仅在高剂量DEHP 500 mg/kg出现显著变化。提示DEHP对CCl4诱导的肝纤维化大鼠的加重作用与炎症因子有关。3.DEHP暴露对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏组织中氧化与抗氧化系统的平衡的影响与正常组相比,CCl4组肝匀浆中MDA明显上升,SOD和GSH明显下降。与CCl4组相比,DEHP(5和500 mg/kg)能显著促进肝匀浆中MDA含量,DEHP500mg/kg可显著降低SOD和GSH活性。提示DEHP暴露加重CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏损伤可能是加重氧化应激,破坏了氧化与抗氧化系统的平衡。4.DEHP暴露对CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏组织中TGF-β1、α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ蛋白表达和分布的影响激光共聚焦法检测肝组织中TGF-β1和α-SMA蛋白表达和分布。与正常组相比,CCl4组肝组织切片中TGF-β1和α-SMA蛋白的表达明显增多,与CCl4组相比,DEHP 500mg/kg能显著促进肝脏组织中TGF-β1蛋白的表达,而DEHP(5和500mg/kg)能显著促进肝组织α-SMA蛋白的表达;免疫组化法检查COL-Ⅰ和COL-Ⅲ蛋白表达和分布发现,与正常组相比,CCl4组肝组织切片中COL-Ⅰ和COL-Ⅲ表达明显增多,与CCl4组相比,DEHP(5和500mg/kg)暴露能显著促进蛋白的表达。5.肝组织中α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表达与正常组相比,CCl4组能够明显上调α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表达;与CCl4组相比,DEHP能显著促进CCl4诱导的肝纤维化大鼠肝脏α-SMA、COL-Ⅰ、COL-Ⅲ、TGF-β1、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表达,尤其是DEHP 500mg/kg影响最明显。提示DEHP可以显著加重肝纤维化的形成,其机制可能是通过TGF-β1/Smad和P38MAPK/NF-κB信号通路有关。6.DEHP对人肝星状细胞LX-2增殖的影响与正常组相比,TGF-β1刺激后显著促进LX-2细胞增殖,与TGF-β1组相比,低浓度DEHP暴露可以显著促进LX-2细胞的增殖,而高浓度DEHP暴露可以抑制细胞的增殖。7.DEHP对TGF-β1刺激的LX-2细胞中ROS含量的影响与正常组相比,TGF-β1刺激后显著提高LX-2细胞中ROS含量,与TGF-β1组相比,DEHP(100μmol/L)能显著提高LX-2细胞中ROS的含量。8.DEHP对TGF-β1刺激的LX-2细胞中α-SMA、COL-Ⅰ、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表达影响研究发现,细胞实验的总体趋势与体内相一致,与正常组相比,TGF-β1刺激后能显著促进α-SMA、COL-Ⅰ、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表达,与TGF-β1组相比,DEHP能显著促进α-SMA、COL-Ⅰ、P-Smad2、P-Smad3、P-p38、P-p65蛋白的表达,尤其在高浓度DEHP 100μmol/L。结论:1.DEHP暴露能显著加重CCl4诱导的肝纤维化大鼠的病理损伤。2.DEHP暴露能显著促进氧化应激的产生,破坏氧化酶与抗氧化酶的动态平衡。提示DEHP加重肝纤维化可能与氧化应激有关。3.DEHP暴露加重肝纤维化的机制可能与TGF-β1/Smad和p38MAPK/NF-κB信号通路有关。
【图文】：

柱状图,体重,和肝,肝指数

因素方差分析进行统计。利用 Graphpad Prism 6 软件进行绘制柱状图。实验结果显示 P<0.01 或 P<0.05 表示统计学有意义。3 结果3.1 DEHP 暴露对 CCl4 诱导的肝纤维化大鼠体重、肝脏指数的影响如图 1A 所示，随着造模时间的延长，CCl4 组从第 30 天起大鼠体重显著低于正常组，DEHP 暴露后能明显加重这种趋势，DEHP （500mg/kg）高剂量暴露组与 CCl4 组相比在 24 天后大鼠体重显著降低。然而，DEHP（0.05 和 5 mg/kg）低中剂量暴露组与 CCl4 组相比，体重没有显著变化。单独暴露 DEHP 组对大鼠体重也无明显影响。肝指数作为肝毒性的指标，我们检测了 DEHP 对肝指数的影响。实验结果表明低中剂量 DEHP 对肝指数影响不明显，但在 CCl4 + DEHP500mg/kg 组中显著性增加（图 1B）。

肝损伤,血清,安徽医科大学,硕士学位论文

安徽医科大学硕士学位论文Compared with the normal group, #p<0.05, ##p<0.01; Compared with CCl4 group, *p<0.05,**p<0.01, n=10 in each group.3.2 DEHP 暴露对 CCl4 诱导的肝纤维化大鼠血清中 AST 和 ALT 的影响AST 和 ALT 水平作为肝损伤的生化指标。与正常对照组相比，CCl4 组和单独DEHP 暴露组血清中 AST 和 ALT 水平显著升高。与 CCl4 组相比，DEHP 暴露显著提高了这些肝酶水平，中高剂量 DEHP（5 和 500 mg/kg）暴露能显著增加AST 水平，，而 ALT 水平仅在 DEHP（500 mg/kg）高剂量组显著增加(图 2A-B)。
【学位授予单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114;R575.2

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