【摘要】：邻苯二甲酸酯(phthalate acid ester,PAEs)是一类人造多功能化学品,用于各种消费品和工业产品。由于PAEs在产品中为非共价结合,因此随着时间的推移,PAEs可以从产品中浸出、迁移,通过摄入、吸入、皮肤接触进入人体。PAEs对生物体具有致癌,致畸和致突变作用,对生殖发育和神经系统也有毒性作用。邻苯二甲酸二丁酯(DBP)是最常用的邻苯二甲酸酯之一,在体内的代谢产物为邻苯二甲酸单丁酯(MBP)。本课题组前期研究发现,10~(-7)M MBP暴露可以增加小鼠睾丸间质肿瘤细胞(MLTC-1细胞)孕酮合成水平。在类固醇生成细胞中,胆固醇是合成孕酮的前体,来自于以脂滴形式存储的胆固醇酯的水解。对于MBP是否可以影响胆固醇酯合成,尚未有研究。在本研究中我们用MLTC-1细胞研究SREBP2-STARD4途径是否参与了MBP促进胆固醇酯合成的过程。目的:1、探讨邻苯二甲酸单丁酯(MBP)对胆固醇酯合成的影响2、探讨类固醇激素合成急性调节蛋白4(STARD4)在MBP促进胆固醇酯合成中的作用方法:1、MBP(10~(-8)-10~(-5)M)处理小鼠睾丸间质细胞(MLTC-1),酶标法测细胞内胆固醇酯含量。2、ORO法观察MLTC-1细胞内胆固醇酯的分布。3、qRT-PCR法测定STARD4和SREBP2 mRNA表达。4、Western Blot法测定STARD4和SREBP2的蛋白表达。5、免疫荧光细胞化学法观察MLTC-1细胞内STARD4表达变化。6、应用RNAi技术下调STARD4的表达,再用MBP(10~(-7)M)处理MLTC-1细胞,观察MLTC-1细胞内胆固醇酯含量。7、应用RNAi技术下调SREBP2表达,再用MBP(10~(-7)M)处理MLTC-1细胞,观察MLTC-1细胞内STARD4蛋白表达水平和细胞内游离胆固醇含量。8、双荧光素酶标记法检测SREBP2与STARD4启动子区域结合活力。结果:1、MBP促进MLTC-1细胞中胆固醇酯的合成MLTC-1细胞暴露于10~(-8)-10~(-5)M MBP后,10~(-7)M MBP剂量下发现细胞内胆固醇酯含量相比对照组明显增加(p0.05),ORO染色发现,脂质染色相比对照组明显加深。2、STARD4在MBP促进MLTC-1细胞胆固醇酯合成中的作用qRT-PCR和Western Blot结果表明,10~(-7)M MBP处理后,MLTC-1细胞STARD4 mRNA和蛋白水平与对照组相比均上升(p0.05)。免疫荧光细胞化学染色联合激光共聚焦法结果显示,10~(-7)M MBP处理后,STARD4在内质网上聚集增多。RNAi实验结果发现,STARD4表达水平与细胞内胆固醇酯水平相关,且再用10~(-7)M MBP处理MLTC-1细胞后,STARD4蛋白表达上升,细胞内胆固醇酯合成增加(p0.05)。3、MBP对SREBP2基因表达的影响qRT-PCR和Western Blot实验结果发现,MBP可促进SREBP2mRNA和蛋白表达水平升高。采用RNAi技术抑制SREBP2表达后,MLTC-1细胞中STARD4蛋白表达下降,再用MBP(10~(-7)M)处理MLTC-1细胞,SREBP2蛋白表达水平回复(p0.05)。4、MBP通过SREBP2-STARD4促进胆固醇酯合成采用RNAi抑制SREBP2表达后,MLTC-1细胞中STARD4蛋白表达下降,细胞内游离胆固醇含量增加。再用MBP(10-~7M)处理MLTC-1细胞,SREBP2和STARD4蛋白表达水平回复,细胞内游离胆固醇含量降低(p0.05)。采用双荧光素酶标记实验发现,SREBP2可与STARD4启动子区域结合,且MBP(10~(-7)M)增加了SREBP2和STARD4启动子区域结合活性(p0.05)。结论:MBP通过SREBP2-STARD4信号通路促进MLTC-1细胞胆固醇酯合成。
【图文】：
南京医科大学硕士学位论文结 果1 MBP 促进 MLTC-1 细胞胆固醇酯合成MLTC-1 细胞暴露于 10-8至 10-5M MBP 24h 后，胆固醇酯的水平在 10-7M 显著增加（图 1A）。 该结果与我们前期研究一致，即暴露于 10-7M MBP 后细胞孕酮合成增加。然后选择 10-7M MBP 的剂量进行 ORO 染色。 如图 1B 所示，与对照组相比，10-7M MBP 处理 MLTC-1 细胞后颜色显著加深。
南京医科大学硕士学位论文正。得出 MLTC-1 细胞中胆固醇酯的水平（A）。 与对照细胞相比，* p <0.05，差异有统计学意义。用油红 O 染色试剂盒染色，经显微镜拍摄的胆固醇酯的 ORO 染色（B），标尺为 100μ m。2 MBP 对 MLTC-1 细胞 STARD4 表达的影响STARD4 可以参与细胞内胆固醇的转运，为了研究 MBP 暴露是否影响MLTC-1 细胞 STARD4 的蛋白表达，，我们将细胞暴露于 10-8至10-5M MBP 24h。结果表明 STARD4 蛋白和 mRNA 表达水平均在 10-7M 剂量上调（图 2A，B和 C）。 因此 MBP 暴露可以促进 MLTC-1 细胞 STARD4 的表达。
【学位授予单位】：南京医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
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