内质网应激和Nrf2信号通路在镉致大鼠毒作用中的调控研究

发布时间：2020-07-07 10:35

【摘要】：目的镉作为重要的生产性毒物和环境污染物,其毒理学机制尚未充分阐明。有研究表明,Nrf2信号因子作为细胞抗氧化应激的中枢调节者,其受内质网应激相关因子PERK直接作用而被激活,从而启动Nrf2信号通路介导的抗氧化机制。另有研究指出,被活化的Nrf2可反馈性减轻内质网应激反应水平。然而,结合内质网应激和氧化应激,在动物水平上研究镉毒性作用过程中内质网应激与Nrf2信号通路的相互作用机制,目前,尚未见报道。因此,本研究拟从体内的角度,以大鼠肾脏、睾丸和卵巢作为靶器官,探讨镉毒性作用过程中对氧化应激、内质网应激和Nrf2信号通路的影响。并进一步通过上调和下调内质网应激水平,以探讨内质网应激对Nrf2信号通路的调控作用。通过诱导和抑制Nrf2信号因子的表达以探讨Nrf2对内质网应激的反馈调节作用。方法选用120只SD大鼠,雌雄各半,检疫合格后按体重随机分为20组,每组6只。第1组:空白对照组;第2-4组:氯化镉低、中、高剂量组;第5组:杆菌肽试剂对照组;第6-8组:杆菌肽+氯化镉低、中、高剂量组;第9组:TUDCA试剂对照组;第10-12组:TUDCA+氯化镉低、中、高剂量组;第13组:tBHQ试剂对照组;第14-16组:tBHQ+氯化镉低、中、高剂量组;第17组:木犀草素试剂对照组;第18-20组:木犀草素+氯化镉低、中、高剂量组。氯化镉的剂量分别为:5μmol/kg、10μmol/kg、20μmol/kg。各组采用腹腔注射方式按10mL/kg体重干预及染毒,一次性染毒48h后处死动物,解剖取出大鼠肾脏、卵巢和睾丸以测定超氧化物歧化酶(SOD)活力、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力、脂质过氧化物丙二醛(MDA)含量,并用RT-PCR和Western blot法测定ERS相关因子和Nrf2信号通路相关因子的mRNA和蛋白表达水平。结果1.氧化应激结果:经过镉染毒48h后,大鼠肾脏组织抗氧化酶SOD、GSH-Px活性在10、20μmol/kg剂量条件下显著下降(P0.05),脂质过氧化的中间产物MDA含量显著上升(P0.05)。大鼠睾丸和卵巢SOD、GSH-Px的活性在5、10μmol/kg剂量下显著下降(P0.05),MDA含量显著升高(P0.05)。2.内质网应激结果:镉在5、10、20μmol/kg剂量下作用48h后,大鼠肾脏Bip、PERK、ATF4基因和Bip、PERK蛋白表达水平均显著升高(P0.05)。在镉中高剂量(10、20μmol/kg)下,大鼠睾丸和卵巢Bip、PERK、ATF4基因和Bip、PERK蛋白表达均有上调(P0.05),尤其在高剂量下上调明显。3.Nrf2信号通路结果:在10μmol/kg染毒剂量条件下,大鼠肾脏Nrf2基因和蛋白均表达均有显著上升(P0.05),下游Ⅱ相解毒酶GST-P1、GCLC mRNA表达也有一定程度的上调(P0.05)。在镉高染毒剂量(20μmol/kg)下,Nrf2蛋白表达水平显著降低(P0.05)。镉在10、20μmol/kg剂量下也可显著上调睾丸和卵巢Nrf2信号因子mRNA和蛋白的表达(P0.05)。而在10、20μmol/kg剂量下,大鼠睾丸GCLC和GST-P1基因表达均有显著上调(P0.05),而大鼠卵巢GCLC和GST-P1在高剂量下(20μmol/kg)虽有上调,但在5和10μmol/kg剂量下大鼠卵巢GST-P1和GCLC的基因表达分别出现显著的下降(P0.05)。4.ERS水平上调和下调后对Nrf2信号因子的调控作用结果:在20μmol/kg剂量条件下,杆菌肽处理组大鼠肾脏PERK蛋白表达水平显著高于同剂量镉单独染毒组(P0.05),在此剂量下,杆菌肽处理组大鼠肾脏Nrf2 mRNA表达水平也出现显著升高(P0.05)。在5、10μmol/kg剂量下,TUDCA处理组大鼠肾脏PERK蛋白表达显著低于同剂量镉单独染毒组(P0.05),但是,在此剂量条件下,Nrf2 mRNA表达变化不明显。经杆菌肽处理后,镉在5μmol/kg剂量条件下,与同剂量镉单独染毒组比较,大鼠睾丸和卵巢Bip mRNA、PERK mRNA、PERK蛋白表达水平均显著升高(P0.05),在此剂量下大鼠睾丸和卵巢Nrf2mRNA表达水平均未出现升高。在10μmol/kg剂量条件下,大鼠睾丸和卵巢Bip蛋白、PERK mRNA和PERK蛋白表达水平与同剂量镉单独染毒组比较均显著下降(P0.05)。5.Nrf2信号因子上调和下调后对镉致内质网应激的反馈调节作用结果:在20μmol/kg剂量条件下,tBHQ处理组大鼠肾脏Nrf2蛋白表达水平与同剂量镉单独染毒组比较显著上升(P0.05),而在此剂量下,tBHQ处理组大鼠肾脏Bip mRNA和蛋白均显著降低(P0.05)。在5μmol/kg剂量下,木犀草素处理组大鼠肾脏Nrf2蛋白表达水平与同剂量镉单独染毒组比较显著下降,在此剂量条件下,大鼠肾脏Bip蛋白和PERK mRNA表达水平同样出现显著地下降(P0.05)。在10μmol/kg剂量条件下,tBHQ处理组大鼠睾丸Nrf2蛋白表达水平与同剂量镉单独染毒组比较显著升高(P0.05),而在此剂量下,大鼠睾丸ERS水平变化不明显。在20μmol/kg剂量条件下,tBHQ处理组大鼠卵巢Nrf2蛋白表达水平与同剂量镉单独染毒组比较显著升高(P0.05),在此剂量下,大鼠卵巢Bip mRNA和蛋白、PERK mRNA表达水平均显著下降(P0.05)。与同剂量镉单独染毒组比较,木犀草素处理后各染毒剂量组大鼠睾丸Nrf2 mRNA和蛋白均显著下降(P0.05),在5μmol/kg剂量下Bip mRNA、PERK蛋白表达水平有所升高(P0.05)。在10、20μmol/kg剂量条件下,木犀草素处理组大鼠卵巢Nrf2 mRNA和蛋白表达水平与同剂量镉单独染毒组比较显著下降(P0.05),而在此中高剂量下,大鼠卵巢Bip蛋白、PERK蛋白表达水平同样出现了明显下降(P0.05)。结论1.在一定染毒剂量条件下,镉可引起大鼠肾脏、睾丸和卵巢发生OS和ERS,并激活Nrf2信号因子,上调Ⅱ相解毒酶的表达,启动Nrf2介导的抗氧化机制。2.在镉毒性作用下,大鼠肾脏、睾丸和卵巢ERS相关因子PERK的表达与Nrf2信号因子的表达存在正相关关系,其中大鼠肾脏PERK与Nrf2信号因子的正相关关系尤为明显。3.在本实验条件下,大鼠睾丸和卵巢对镉毒性作用的敏感程度可能高于大鼠肾脏,而雌性大鼠卵巢可能比雄性大鼠睾丸更容易受到镉毒性作用的损害。4.在镉毒性作用过程中,镉所致大鼠肾脏ERS对Nrf2信号因子有正向调控作用,但ERS水平的下降并不能明显抑制Nrf2信号因子活性。Nrf2表达的上调可一定程度地减轻ERS水平,但Nrf2活性被抑制后并不会反馈性引起ERS水平的增强。5.镉致大鼠睾丸和卵巢ERS对Nrf2信号因子正向调控作用不明显,但ERS水平的下降均可明显抑制Nrf2信号因子活性。当Nrf2的表达增强后,大鼠卵巢ERS水平得以减轻,大鼠睾丸此作用不明显。而当Nrf2活性受到抑制后却可反馈性地引起大鼠睾丸ERS水平的增强,大鼠卵巢此作用不明显。
【学位授予单位】：广东药科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
【图文】：

广东药科大学硕士研究生学位论文表 2-1 镉对大鼠肾脏 SOD、GSH-Px 活性及 MDA 含量的影响( )组别 SOD(×103U/g) GSH Px(×103U/g) MDA(μmol /g)0 μmol/kg 组 385.45±9.74 500.23±13.73 6.70±0.385 μmol/kg 组 325.28±18.40a493.93±15.08 6.90±1.4210 μmol/kg 组 292.58±7.94ab454.80±18.17ab9.28±0.65ab20 μmol/kg 组 310.16±15.22ac438.41±.34.04ab8.70±0.90ab与 0 μmol/kg 组比较，aP<0.05；与 5 μmol/kg 组比较，bP<0.05；与 10 μmol/kg 组比较，cP<0.05

广东药科大学硕士研究生学位论文表 2-2 镉对大鼠睾丸和卵巢组织 SOD、GSH-Px 活性及 MDA 含量的影响（ ）组别SOD(×103U/g) GSH Px(×103U/g) MDA(μm睾丸 卵巢 睾丸 卵巢 睾丸 卵ol/kg 组 212.01±13.67 274.94±18.48 545.69±20.27 521.34±21.40 8.44±0.87 6.76ol/kg 组 195.98±7.88a245.49±31.50a382.89±57.50a437.88±40.70a10.30±1.54a7.16ol/kg 组 189.90±8.46a203.54±21.98ab351.78±28.26a404.15±66.44a13.65±1.13ab9.73±ol/kg 组 163.67±8.18abc220.00±8.62ab397.52±24.52ac428.37±16.19a12.95±1.80ab9.87±与 0 μmol/kg 组比较，aP<0.05；与 5 μmol/kg 组比较，bP<0.05；与 10 μmol/kg 组比较，cP<0.05

图 2-2 镉对大鼠睾丸氧化应激的影响A：SOD 活性；B：GSH-Px 活性；C：MDA 含量；与 0 μmol/kg 组比较，aP<0.05；与 5 μmol/kg组比较，bP<0.05；与 10 μmol/kg 组比较，cP<0.05

【参考文献】

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本文编号：2745015