卡耶塔环孢子虫分离株群体遗传结构特征及常见果蔬携带情况研究

发布时间：2020-07-31 16:26

【摘要】：环孢子虫(Cyclospora)是一种新近出现的食源性传播,人和动物体肠道上皮细胞寄生,广泛地引起宿主胃肠炎或腹泻症状的寄生性原虫。到目前,环孢子虫具有20个种,其中卡耶塔环孢子虫(Cyclospora cayetanensis)是唯一感染人体的种类。自1990s以来,人体环孢子虫病在世界范围内有大量零星和暴发感染的报道,溯源研究显示与呈地方流行地区旅游归来或消费受污染的食物有关。同时,环孢子虫的感染具有明显的季节性分布(主要发生在夏季或雨季),且许多肠道寄生原虫(包括:隐孢子虫、环孢子虫、十二指肠贾第虫、微孢子虫、弓形虫)与生的或未经煮熟的蔬菜/水果的食入具有显著的相关性。为了解我国河南地区人体环孢子虫的分子流行病学和卡耶塔环孢子虫的群体遗传结构,以及果蔬表面寄生原虫的携带感染情况开展本研究,以期为人体环孢子虫传播方式及其病的防控提供支持。我国卡耶塔环孢子虫分离株(n=102)卵囊的平均大小为8.49±0.12μm×8.26±0.12μm,卵形指数为1.03。河南地区(郑州和开封)住院病人环孢子虫的分子流行病学调查显示,总体感染率为1.2%(76/6579),各个年龄段均有环孢子虫的感染(P0.05)。在2011-2015年期间,环孢子虫的总体感染率呈下降趋势。本调查结果与洪都拉斯医院住院病人样本中环孢子虫的感染率(1.3%)类似;而显著高于墨西哥儿科医院病人的感染率(0.67%);低于尼泊尔在校儿童和意大利住院病人的感染率。基于SSU rRNA基因、ITS基因和HSP70蛋白基因的分子种系进化分析显示,所获得的环孢子虫分离株与已报道的墨西哥,波兰,中国,尼泊尔和秘鲁的卡耶塔环孢子虫分离株均聚集于同一进化分枝。然而,仅依靠单一基因的进化分析是不充分或是不可靠的,应该检测多个基因位点,进行多位点序列分析。卡耶塔环孢子虫阳性分离株(n=76)多位点序列分析(MLST)结果显示,环孢子虫五个微卫星位点(CYC3,CYC13,CYC15,CYC21和CYC22)分别成功扩增数为49、59、57、52和56个,共有45个分离株样本在五个微卫星位点均成功扩增。微卫星位点CYC21显示比其它位点具有更高的基因多态性和分辨率。这45个卡耶塔环孢子虫分离株共形成29个多位点基因型(MLG26-MLG54)。在全球范围内报道的79个卡耶塔环孢子虫分离株(包括34个已知分离株的参考序列)共形成了54个多位点基因型(MLG1到MLG54),29个单倍型(haplotypes),64个多态性位点(polymorphic sites)。环孢子虫群体遗传结构分析显示具有显著但不完全的连锁不平衡性,且为克隆性群体遗传结构;重组分析显示存在极少的重组事件数(Rm=5)。基于环孢子虫5个微卫星位点的串联序列形成54个多位点基因型(MLG)的分子种系发育分析,结果共产生了3个主分枝。使用STRUCTURE软件基于环孢子虫五个微卫星位点等位基因序列图谱进行的群体遗传结构分析显示,ΔK在K=3时达到峰值,共形成了3个亚群。MLST分析方法为卡耶塔环孢子虫的群体遗传学的研究提供了重要的新视角。蔬菜/水果表面隐孢子虫卵囊洗脱方法优化的研究表明,采取往返振荡方式,振荡频率为100次/min,振荡时间为1h(期间每15 min翻转一次),洗脱液采用1%Alconox~?,其总体回收率最高。显微镜计数分别采用第一次洗脱液和第二次洗脱液之和时,回收率达到71.40%(31.42×10~4/44.00×10~4)。其回收率高于之前报道的基于免疫磁珠检测生菜表面微小隐孢子虫卵囊的回收率;而低于基于流式细胞仪检测,同样使用1%Alconox~?作为洗涤液的回收率。在商业化试剂盒提取水溶液中隐孢子虫卵囊基因组DNA质量的比较研究中,土壤DNA提取试剂盒与粪便DNA提取试剂盒提取DNA的质与量在统计学上无显著性差异。然而,土壤DNA试剂盒耗时较短,粪便DNA试剂盒成本较低。综上所述,本研究部分以生菜为研究对象,优化了蔬菜/水果表面携带原虫的洗脱方法,为之后病原携带情况的调查研究提供了技术支持。我国河南(郑州和开封)地区蔬菜/水果表面携带寄生性肠道原虫(隐孢子、贾第虫、环孢子虫和微孢子虫)的检测结果显示,其总体携带感染率为3.8%(42/1099)。其中毕氏肠微孢子虫感染率最高为3.5%(39/1099),只检测到少量的卡耶塔环孢子虫(n=2)和微小隐孢子虫(n=1),未检测到十二指肠贾第虫的感染。然而,在波兰蔬菜/水果表面携带的微孢子虫感染率达到11.3%(9/80),显著高于本研究(P0.01)。值得注意的是,蔬菜/水果表面感染的微孢子虫基因型EbpC在中国和美国的人体内报道,显示其具有较强的人体致病性。本研究中,卡耶塔环孢子虫和微小隐孢子虫分别仅鉴定于生菜,油麦菜和韭菜表面。蔬菜/水果表面携带隐孢子虫和环孢子虫感染的报道,亦常见于韩国,加纳和埃塞俄比亚等国家。这是我国首次进行果蔬表面微孢子虫、卡耶塔环孢子虫和微小隐孢子虫等原虫携带情况的报道。综上所述,我国河南地区住院病人的环孢子虫总体感染率较低,MLST分析显示卡耶塔环孢子虫群体具有连锁不平衡性,且为克隆性群体遗传结构。同时,本研究优化了蔬菜/水果表面携带原虫的洗脱方法,为之后的调查研究提供了技术支持。并对河南地区果蔬表面毕氏肠微孢子虫,卡耶塔环孢子虫和微小隐孢子虫携带感染情况进行了报道。然而,来自于人体和其它来源(动物、土壤、蔬菜和水源)MLST数据有待深入研究,并对其传播途径和风险进行评估。
【学位授予单位】：河南农业大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R155.5
【图文】：

环孢子虫,卵囊,形态结构,图片

数量不定的黑色包涵体；孢子化卵囊内含有两个孢子囊，且每个孢子囊内含有两个子孢子[13]（图1）。这种环孢子虫卵囊常规的检测方法具有操作简单，设备需求低的特点；但是也伴随着敏感性低和检测时间长等缺点，以及也容易受到工作人员知识水平和视觉易疲劳的限制，及粪便中假阳性或假阴性杂质的影响[12]。2.2 环孢子虫卵囊荧光显微镜检测由于环孢子虫卵囊壁可在 330～380 nm 的紫外滤光器下卵囊壁自发蓝色荧光，在 450～490 nm 滤光器下卵囊壁自发绿色荧光，利用其卵囊的这种特性已经在临床上建立了快速检测和鉴定环孢子虫感染的方法[14]，同时已经应用于人体卡耶塔环孢子虫的临床检测和流行病学的研究[7]。近些年来，还出现了一种可检测环境和临床样本中是否存在环孢子虫卵囊的流式细胞术新方法

环孢子虫,核糖体DNA,单元结构

3.1 基因位点环孢子虫研究中最常用的基因序列有 SSU rRNA[5]和 ITS[18]，以及新近获得的热休克 70蛋白（Heat shock 70 kDa，HSP70）基因序列[43]。卡耶塔环孢子虫（C. cayetanensis）的核糖体 DNA 基因的结构单元示意图如图 2。需要特别注意的是，由于 SSU rRNA 基因序列具有高度的保守性，因此基于 SSU rRNA 基因区分人体卡耶塔环孢子虫（C. cayetanensis）或者其它种类环孢子虫种的不同分离株之间的遗传进化关系十分实用。已经有研究者利用环孢子虫 SSU rRNA 基因将环孢子虫和其它种类的顶复门寄生原虫进行区分[19]。另外，分析来源于人类和狒狒源的环孢子虫分离株之间的 SSU rRNA 基因序列显示分别有 0.78%和 0.73%的差异[45]。在另一项研究中显示，C. papionis，C. colobi，和 C. cercopitheci 的 SSU rRNA 基因与人类的分离株有 0.3～0.6%的序列差异[5]。针对其它种类动物体内存在的环孢子虫样品的SSU rRNA 基因序列的研究亦在进行，主要有非人灵长类和奶牛等动物。2010 年报道，高振永等研究者[29]等根据猴源环孢子虫分离株的 SSU rRNA 基因序列，设计了两对相对保守性引物，并进行了不同样本之间的特异性和敏感性研究。随后，Li 等研究者[28]对肯尼亚捕获狒狒的粪便样本，扩增了其 SSU rRNA 基因的部分序列，鉴定的虫种均为 C. papionis，并对其分离株序列进行了种系发育进化分析。

序列,环孢子虫,线粒体基因组,基因组

河南农业大学 2018 届博士研究生学位论文株的内部转录间隔区（ITS）序列（8.3%）比危地马拉分离株（3.8%）序列差异大。在 1996年，美国环孢子虫病暴发期间获得的 5 份人源环孢子虫分离株的 ITS-1 序列一致，然而在危地马拉和秘鲁的环孢子虫分离株的 ITS-1 序列差异显著。共感染和多拷贝也许能解释不同分离株之间 ITS-1 序列的变异性。人体卡耶塔环孢子虫（C. cayetanensis）和狒狒源环孢子虫（C. papionis）的 5.8S rRNA 基因已经获得，显示其不同分离株之间高度的保守性[2]。在 2013年，Sulaiman 等研究者[43]，开发了一种基于 HSP70 蛋白基因的快速检测卡耶塔环孢子虫（C.cayetanensis）的方法，结果显示不同环孢子虫分离株之间的 HSP70 基因具有较高的保守性。在另一项研究，基于 SSU rRNA 和 HSP70 基因位点序列显示，全球范围内不同地区来源的环孢子虫分离株不存在地理隔离[44]。

【相似文献】