MC-LR通过氧化应激调控小鼠卵巢细胞ERs及自噬

发布时间：2020-08-05 16:20

【摘要】：目的微囊藻毒素-LR(Microcystin-leucine arginine,MC-LR)是由蓝藻释放的环状七肽细胞内毒素,具有强烈的生殖毒性。然而,人们对它诱导的雌性生殖系统毒性知之甚少,同时氧化应激在内质网应激和自噬中起着至关重要的调控作用。然而,之前没有研究ROS介导的MC-LR诱导下通过内质网应激和自噬结合起来的生殖毒性。因此,本研究旨在探讨MC-LR或MC-LR与N-乙酰基-L-半胱氨酸(N-acetyl-l-cysteine,NAC)联合作用后体内外的氧化应激水平及抗氧化能力。此外,将探索氧化应激对MC-LR诱导的内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERs)和自噬的调控作用,并揭示NAC对MC-LR诱导的生殖毒性的保护作用及分子机制。方法不同浓度MC-LR(0、1、5、10、20、40、60μg/mL)或不同浓度NAC(0、1、5、10、15、20、40、60 mmol/L)培养KK-1细胞24 h,通过CCK-8试剂盒联合酶标仪进行细胞活性检测,确定MC-LR的半数抑制浓度(inhibitory concentration 50,IC_(50))和NAC的后续实验浓度。MC-LR(0、8.5、17、34μg/mL)及MC-LR与NAC联合作用(34μg/mL MC-LR+10 mmol/L NAC)KK-1细胞24 h后,分别检测KK-1细胞中ROS含量、SOD活性、细胞凋亡率及GSH/GSSG;Western Blotting实验检测细胞中MC-LR的蓄积、内质网应激及自噬相关蛋白的相对表达水平。MC-LR(0、12.5、25、40μg/kg·BW)及MC-LR与NAC联合(40μg/kg·BW MC-LR+200 mg/kg·BW NAC)染毒C57BL/6小鼠14天后,检测卵巢组织中ROS含量、SOD活性、MDA的含量及GSH/GSSG;HE染色观察小鼠卵巢组织病理变化;透射电子显微镜观察小鼠卵巢颗粒细胞的超微结构;TUNEL染色观察小鼠卵巢组织颗粒细胞凋亡率;Western Blotting检测小鼠卵巢组织中MC-LR的蓄积、内质网应激及自噬相关蛋白的相对表达水平。结果不同浓度MC-LR染毒KK-1细胞24 h后,计算出MC-LR的IC_(50)为34μg/mL;当KK-1细胞暴露不同浓度NAC时,浓度为10 mmol/L时细胞活性最好,因此选取浓度10 mmol/L为NAC后续实验浓度;Western Blotting检测发现不同浓度MC-LR均可以进入KK-1细胞和C57BL/6小鼠卵巢组织中,并且随着染毒浓度的增大,MC-LR的蛋白条带逐渐加深。MC-LR可以引起KK-1细胞内ROS大量产生,同时降低KK-1细胞的抗氧化能力(SOD活性及GSH/GSSG下降),而抗氧化剂NAC可以缓解MC-LR引起的氧化应激和增强抗氧化能力;MC-LR也可以引起C57BL/6小鼠卵巢组织氧化应激的发生(ROS和MDA含量增加),同时降低SOD活性及GSH/GSSG的比率,而NAC的预处理可以抵抗MC-LR引起的氧化应激,同时可以增强GSH/GSSG比率。尽管在NAC预处理后SOD活性略微上调,但与MC-LR(40μg/kg·BW)组相比没有显著差异。MC-LR可以诱导C57BL/6小鼠卵巢组织及超微结构发生病理损伤,而预先加入氧化应激抑制剂NAC后可以缓解MC-LR诱导的小鼠卵巢组织及超微结构的病理损伤。MC-LR可以增加KK-1细胞和C57BL/6小鼠卵巢组织中内质网应激和自噬相关蛋白的相对表达。预先NAC干预后,在KK-1细胞中,内质网应激相关通路蛋白CHOP、XBP1、P-EIF2α、GRP78和P-PERK表达与单独染毒组(34μg/mL)相比显著下降(P0.05),自噬相关蛋白Beclin1、ATG12、ATG5-ATG12、ATG16及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ的表达与单独染毒组(34μg/mL)相比也显著下降(P0.05);在小鼠卵巢组织中,内质网应激相关通路蛋白表达与40μg/kg·BW剂量组相比显著下降(P0.05),自噬相关蛋白Beclin1、ATG5-ATG12、ATG16表达与40μg/kg·BW剂量组相比显著下降(P0.05)。MC-LR同时可以引起小鼠卵巢组织颗粒细胞凋亡率增加,而抑制氧化应激可以抵抗MC-LR诱导的细胞凋亡。结论1.MC-LR可以引起KK-1细胞和C57BL/6小鼠卵巢氧化应激2.氧化应激调控MC-LR诱导的KK-1细胞和C57BL/6小鼠卵巢内质网应激及自噬。
【学位授予单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
【图文】：

图 3.1 MC-LR 及 NAC 对 KK-1 细胞活性的影响注：A 代表 MC-LR 对 KK-1 细胞活性的影响；B 代表 NAC 对 KK-1 细胞活性的影响。*代表与对照组相比，P<0.05，差异有统计学意义。3.2 不同浓度 MC-LR 可以进入 KK-1 细胞和 C57BL/6 小鼠卵巢组织KK-1 细胞或 C57BL/6 小鼠暴露不同浓度的 MC-LR，然后使用 WesternBloting 检测 KK-1 细胞或者卵巢组织中是否有 MC-LR 存在。如图 3.2 所示，在单独 NAC 组和对照组中未发现 MC-LR 条带（体外：0 μg/mL，体内：0 μg/kg BW）。但低剂量组（体外：8.5 μg/mL，体内：12.5 μg/kg BW）、中剂量组（体外：17 μg/mL，体内：25 μg/kg BW）、高剂量组（体外： 34 μg/mL，体内：40 μg/kg BW）和NAC+MC-LR 组均发现 MC-LR 带，并且随着染毒浓度的增大，条带变得越来越深，这表明 MC-LR 可以进入 KK -1 细胞或卵巢组织中。

图 3.1 MC-LR 及 NAC 对 KK-1 细胞活性的影响注：A 代表 MC-LR 对 KK-1 细胞活性的影响；B 代表 NAC 对 KK-1 细胞活性的影响。*代表与对照组相比，P<0.05，差异有统计学意义。3.2 不同浓度 MC-LR 可以进入 KK-1 细胞和 C57BL/6 小鼠卵巢组织KK-1 细胞或 C57BL/6 小鼠暴露不同浓度的 MC-LR，然后使用 WesternBloting 检测 KK-1 细胞或者卵巢组织中是否有 MC-LR 存在。如图 3.2 所示，在单独 NAC 组和对照组中未发现 MC-LR 条带（体外：0 μg/mL，体内：0 μg/kg BW）。但低剂量组（体外：8.5 μg/mL，体内：12.5 μg/kg BW）、中剂量组（体外：17 μg/mL，体内：25 μg/kg BW）、高剂量组（体外： 34 μg/mL，体内：40 μg/kg BW）和NAC+MC-LR 组均发现 MC-LR 带，并且随着染毒浓度的增大，条带变得越来越深，这表明 MC-LR 可以进入 KK -1 细胞或卵巢组织中。

图 3.3 不同浓度 MC-LR 对 KK-1 细胞 ROS 的影响及 NAC 的抑制作用注： 流式细胞仪检测。A：对照组； B：8.5 μg/mL；C：17 μg/mL；D：34 μg/mL；E：34 μg/mL + NAC；F：NAC；G：KK-1 细胞中 ROS 平均荧光强度的定量分析。*代表与对照组相比，P<0.05，差异有统计学意义，#代表与单独 34 μg/mL 剂量组相比，P<0.05，差异有统计学意义。

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本文编号：2781734