PLK1介导的信号在纳米级炭黑致遗传损伤中的作用研究

发布时间：2020-08-07 21:55

【摘要】：目的:探讨纳米炭黑颗粒(Carbon black nanoparticles,CBNPs)的遗传毒性,以及PLK1介导的信号在纳米炭黑致遗传损伤中的作用及可能的分子机制。方法:扫描电子显微镜观察CBNPs的表面形态,透射电子显微镜测量其尺寸,并通过Brunauer-Emmett-Teller(BET)吸附等温式计算纳米炭黑的比表面积,纳米粒子分析仪测定zeta电位。建立动式吸入CBNPs染毒大鼠模型,染毒组浓度分别为5、30 mg/m3,每天6小时,连续染毒28天。建立CBNPs处理16HBE细胞24小时体外染毒模型,剂量分别为0、50、100、200μg/m L。脂质体转染PLK1表达质粒pc DNA3-PLK1,经800μg/m L G418筛选,Western blot检测PLK1蛋白表达水平,构建稳定高表达PLK1的16HBE细胞株,100μg/m L CBNPs处理PLK1高表达细胞24小时,分别以16HBE细胞、转染质粒pc DNA3.1细胞作为阴性对照和转染对照。应用SDS-PAGE电泳法测定16HBE细胞内CBNPs含量;流式仪检测细胞凋亡和周期;HE染色观察肺组织病理变化;彗星试验检测细胞DNA损伤;微核试验检测染色体损伤;宿主细胞恢复活性实验测定细胞DNA修复能力;Western blot检测DNA损伤及修复相关蛋白表达水平。结果:1.纳米炭黑的表征扫描电子显微镜及透射电子显微镜显示CBNPs为30~50 nm的球形颗粒,可组成数十到数百纳米的聚集体。BET法测定CBNPs的比表面积约为74.85 m2/g,纳米粒子分析仪测定CBNPs的zeta电位为-15.37 MV。2.细胞内炭黑的含量50μg/m L、100μg/m L和200μg/m L染毒组中,16HBE细胞摄取CBNPs的量分别为6.57±1.99μg、11.67±1.06μg、18.26±4.96μg,200μg/m L剂量组摄取入16HBE细胞内CBNPs量明显高于50μg/m L剂量组(P0.05)。3.纳米炭黑颗粒诱导大鼠肺组织病理损伤与对照组相比,染毒组肺组织病理切片中可见炎性细胞浸润,肺泡壁增厚,30 mg/m3染毒剂量组可见出血及巨噬细胞脱落。4.纳米炭黑的遗传损伤作用大鼠吸入CBNPs染毒28天后,与对照组相比,各剂量染毒组大鼠肺细胞Tail DNA%均显著增加(P0.05),30 mg/m3剂量组的大鼠肺细胞OTM较对照组显著增加(P0.05)。各剂量染毒组大鼠骨髓微核率均较对照组显著增加(P0.05)。与对照组相比,各剂量染毒16HBE细胞的OTM值及Tail DNA%呈剂量依赖性增加,细胞胞质分裂阻滞增值指数较对照组显著降低(P0.05),微核率显著增加(P0.05),并有良好的剂量反应关系。宿主细胞恢复活性实验结果显示,与对照相比,50μg/m L和100μg/m L剂量组虫荧光素酶和海肾荧光素酶的比值显著升高(P0.05),提示DNA修复能力增强,与50μg/m L和100μg/m L剂量组相比,200μg/m L剂量组中虫荧光素酶和海肾荧光素酶的比值降低。5.纳米炭黑对细胞凋亡和细胞周期的影响与对照组相比,染毒16HBE细胞G0/G1期细胞比率下降,G2/M期细胞比率增加,细胞存活率降低,晚期凋亡率和坏死率增加,差异均具有统计学意义(P0.05),早期凋亡率变化无统计学差异(P0.05)。6.PLK1介导的信号在纳米炭黑致遗传损伤中的作用与对照组相比,各剂量染毒组大鼠肺细胞的PLK1蛋白表达量显著降低(P0.05),且有良好的剂量反应关系。与对照相比,100μg/m L和200μg/m L剂量染毒组16HBE细胞PLK1蛋白表达水平显著降低(P0.05),GADD45α、Ch K2蛋白表达水平显著增加(P0.05),50μg/m L和100μg/m L剂量组XRCC1表达量显著增加(P0.05),与50μg/m L和100μg/m L剂量组相比,200μg/m L剂量组XRCC1蛋白表达水平下降(P0.05)。16HBE细胞转染质粒pc DNA3-PLK1及G418筛选后,PLK1蛋白表达水平约是control及转染质粒pc DNA3.1细胞的2倍,差异具有统计学意义(P0.05),说明PLK1高表达细胞株建立成功。100μg/m L CBNPs处理后,与control和转染质粒pc DNA3.1细胞相比,PLK1高表达细胞株未发生G2/M期阻滞,细胞存活率增加,晚期凋亡率及死亡率降低,Tail DNA%和OTM值减小,胞质分裂阻滞增值指数、复制指数增加,微核率降低,Ch K2、GADD45α及XRCC1蛋白表达降低,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论:1.纳米炭黑颗粒可以导致遗传损伤,并具有良好的剂量反应关系。2.PLK1介导的信号在纳米炭黑致遗传损伤中发挥重要作用。
【学位授予单位】：河北医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
【图文】：

气溶胶浓度,环境,比表面积,理化参数

1. CBNPs 的表面特征扫描电镜和透射电镜测得 CBNPs 粒径尺寸为 30~50 nm，其组成数十到数百纳米的聚集体，应用 BET 法测定其比表面积约为 74.85 m2/g，zeta电位为-15.37 MV。结果见表 1。表 1 CBNPs 理化特征参数Table 1 Physicochemical parameters of the CBNPs理化参数 CBNPs颗粒尺寸 30~50 nm，球形比表面积 74.85 m2/gZeta 电势 -15.37 MV2. 动式吸入染毒系统的环境及 CBNPs 气溶胶浓度的检测AB

肺泡壁,增厚,柱状细胞,细支气管

研究论文常，光镜下可见由单层柱状细胞构成的细支气管结构完整，纤毛完整无脱落。5 mg/m3染毒肺组织中可见少量炎性细胞浸润，局部可观察到肺泡壁轻微增厚。30 mg/m3染毒组肺组织大量炎性细胞浸润，可见大量出血，肺泡壁显著增厚，并见巨噬细胞脱落。结果见图 2。AB

遗传损伤,大鼠,大鼠肺细胞

4. 纳米炭黑颗粒诱导大鼠遗传损伤4.1 彗星试验图3所示，5 mg/m3染毒组大鼠肺细胞的TailDNA%为2.20%，30 mg/m3染毒组的 TailDNA%为 6.27%，与对照组(1.41%)相比均有统计学差异(P<0.05)。与对照组 OTM 值(0.42)相比，5 mg/m3染毒组大鼠肺细胞 DNA的 OTM 值(0.61)改变无统计学差异，30 mg/m3剂量组的 OTM 值(2.65)显著增加且有统计学意义(P<0.05)。CAB

【参考文献】