砷暴露引发神经元铁死亡的初步研究

发布时间：2020-08-07 13:40

【摘要】：第一部分砷暴露引发小鼠皮层神经元铁死亡的研究目的:探究砷暴露引发的小鼠皮层神经元丢失是否与铁死亡有关。方法:选32只7周龄的健康雄性C57BL/6J小鼠,随机平均分为高剂量砷组(50 mg/L)、中剂量砷组(5 mg/L)、低剂量砷组(0.5 mg/L)以及对照组(蒸馏水)4组,每组8只,采用饮水暴露的方式染毒6个月。通过HE染色观察神经元形态;免疫荧光的方法检测神经元标记物NeuN和MAP2在皮层中的表达;透射电镜观察皮层神经元内线粒体超微结构;SOD、GSH试剂盒检测皮层组织中SOD、GSH含量;MDA、ATP、铁试剂盒检测组织总体和线粒体中MDA、ATP、铁含量;Western-blot和qPCR检测铁死亡相关基因(IREB2、SLC7A11、VDAC3、GPX4)的表达水平;Western blot检测MAPK通路蛋白pJNK1/2和pERK1/2,内质网应激蛋白GRP78和CHOP表达水平。结果:(1)慢性砷暴露后,HE染色、NeuN与MAP2荧光结果显示小鼠皮层有神经元丢失,NeuN和MAP2荧光在中剂量(5 mg/L)与高剂量组(50 mg/L)中减少十分明显,与对照组相比差异有统计学意义(P0.05);(2)皮层线粒体超微结构显示,高剂量组(50 mg/L)中,线粒体嵴明显减少或者消失,线粒体膜密度浓缩,出现严重的空泡样损伤;(3)高剂量组小鼠皮层组织中SOD的活力与GSH的含量与对照组相比明显减少(P0.05);高剂量组脂质过氧化物MDA与ATP在皮层组织中总体含量以及线粒体中的含量与对照组相比明显减少(P0.05);Fe~(2+)在皮层组织中总体含量以及线粒体中的含量在砷暴露组中的含量相比于对照组明显增加(P0.05);(4)各剂量组中IREB2、SLC7A11、GPX4蛋白与mRNA表达量逐渐降低,而VDAC3蛋白与mRNA表达量逐渐增加;(5)砷暴露组皮层组织内置网激活蛋白GRP78和CHOP表达量相较于对照组增加,MAPK通路激活蛋白pJNK1/2和pERK1/2表达水平也增加(P0.05)。结论:慢性砷暴露会引发小鼠大脑皮层神经元的丢失,线粒体结构与功能的破坏,脂质过氧化物与Fe~(2+)的堆积,内质网、MAPK通路的激活以及铁死亡相关基因表达的改变,表明慢性砷暴露可能引起小鼠皮层神经元发生铁死亡。第二部分砷暴露引发PC-12细胞铁死亡的研究目的:探究砷是否会诱导PC-12细胞发生铁死亡。方法:PC-12的细胞活性检测用CCK-8法;MitoSOX~(TM)红色荧光探针标记细胞中线粒体活性氧,并通过流式细胞术进行检测。结果:(1)砷暴露后PC-12细胞活性明显降低,铁死亡抑制剂DFO能有效抑制砷对PC-12的细胞毒性;(2)砷暴露可显著增加PC-12细胞中线粒体ROS,而DFO能有效抑制砷引起的细胞内线粒体ROS升高,差异均有统计学意义(P0.05)。结论:砷可引起PC-12细胞活性降低、线粒体活性氧增加,铁死亡抑制剂能通过抑制线粒体ROS途径抑制砷的细胞毒性,表明砷暴露可能诱导PC-12细胞发生铁死亡。
【学位授予单位】：重庆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
【图文】：

图 1-1 砷处理后小鼠皮层 H&E 染色结果（100×，400×）Fig.1 H&E staining of cerebral cortex after arsenite treatment (magnification, 100 and 400.2 砷暴露对皮层组织中 NeuN、MAP2 表达水平的影响用免疫荧光的方法标记各组小鼠皮层组织的神经元中特异性神经元标记euN，结果显示随着亚砷酸钠染毒剂量的增加，NeuN 的表达量逐渐降低（-2A），中剂量与高剂量组小鼠最为明显，与对照组小鼠相比差异有统计学意P<0.05）（图 1-2B）。考虑到 NeuN 标记可能是由于蛋白质耗尽或者丢失其抗原性而造成，故选用一个神经元标记物 MAP2。结果同样，发现随着亚砷酸钠染毒剂量的增加，MA表达量也逐渐降低，对照组与砷处理组比较差异均有统计学意义（P<0.05）（-2A 和 2B）。

结果显示随着亚砷酸钠染毒剂量的增加，NeuN 的表达量逐渐降低（图1-2A），中剂量与高剂量组小鼠最为明显，与对照组小鼠相比差异有统计学意义（P<0.05）（图 1-2B）。考虑到 NeuN 标记可能是由于蛋白质耗尽或者丢失其抗原性而造成，故选用另外一个神经元标记物 MAP2。结果同样，发现随着亚砷酸钠染毒剂量的增加，MAP2的表达量也逐渐降低，对照组与砷处理组比较差异均有统计学意义（P<0.05）（图1-2A 和 2B）。

图 1-2 各组小鼠皮层中 NeuN、MAP2 的荧光强度（100×，400×）注：*P<0.05 ,***P<0.001 与对照组相比较Fig.1-2 Fluorescence intensity of NeuN and MAP2 in cortex of mice in eacgroup(magnification, 100 and 400)Note：* denoted P<0.05 and ***denoted P<0.001, compared with the contr暴露对小鼠皮层线粒体的超微结构的影响 6 月后，采用透射电镜观察皮层组织中线粒体超微结构，结果显线粒体嵴明显减少或者消失，线粒体膜密度浓缩，出现严重的空1-3）。

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本文编号：2784072