食源性致病菌恒温扩增试纸条检测研究

发布时间：2020-08-08 23:44

【摘要】：金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌是两类严重威胁食品安全的致病菌,由两种致病菌造成的中毒事件较多。目前传统微生物检测鉴定既费时又费力,基于聚合酶链式反应的方法是灵敏度高,但依赖于精密、昂贵的设备和专业操作人员,限制了其应用。本研究中建立了重组酶聚合酶恒温扩增(RPA)和试纸条(LF)结合的方法,用于快速检测金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌,该方法操作简便,灵敏度高,特异性强。RPA是一种新型的扩增方法,可以在较低的温度下(37℃～42℃)下,，220min内完成检测,是被称为最接近“等温扩增”的方法。本实验以金黄色葡萄球菌和单增李斯特菌特异基因为模板设计引物,将正反引物分别标记地高辛(digoxin)和生物素(biotin),经RPA扩增后生成双标记的DNA产物,其与胶体金或彩色乳胶微球标记的抗digoxin抗体发生相互作用后携带有显色物质,最终可以在LF上出现肉眼可见的结果。本研究对RPA-LF检测金黄色葡萄球菌的条件进行了优化,结果显示RPA扩增金黄色葡萄球菌的最佳条件为40℃扩增10min,灵敏度分析结果显示RPA-LF可检测500 fg DNA和1.2 X 101 CFU/mL金黄色葡萄球菌纯菌液;特异性结果显示RPA-LF特异性良好,对表皮葡萄球菌、腐生葡萄球菌、肠炎沙门氏菌等均没有交叉反应;利用鸡肉、牛奶、鸡蛋等实际样品检验方法的检测效果,结果显示经过增菌和检测后,在4.5小时内可检出食品样品中1.2×100CFU/mL(g)的金黄色葡萄球菌。本研究同样优化了 RPA-LF检测单增李斯特菌的方法,结果显示RPA扩增单增李斯特菌的最佳条件为39℃扩增10 min;灵敏度分析结果显示RPA-LF可检测300 fg基因组DNA和1.5 X 101CFU/mL单增李斯特菌纯菌液;特异性结果显示RPA-LF未与格氏李斯特菌、西尔李斯特菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气肠杆菌、霍乱沙门氏菌和志贺氏菌发生交叉反应;用食物样品评估RPA-LF检测效果,结果显示增菌6 h后,检测限为1.5×100CFU/mL(g)。重组聚合酶恒温扩增结合试纸条检测具有快速、高特异性和高灵敏度等优点。实际样品的检测过程仅需4.5～6h,不需要复杂的热循环装置,只需一台简单的数字化水浴锅即可完成检测,同时对操作人员的技术要求不高,非常适用于食品企业和偏远地区致病菌的快速检测。
【学位授予单位】：天津科技大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R155.5
【图文】：

金黄色葡萄球菌,产气杆菌,实验室,阴性

它常见食源性致病菌株的基因组ＤＮＡ，产物未检测出非特异性扩增的条带，由此说逡逑明引物特异性强，而且条带清晰明亮，故选择／＾ｃ－Ｆｌ／ｍ＾－Ｒｌ作为后续试验所用引物，逡逑见图３－１和３－２。逡逑图３－１邋？ｍｏＦ１／？？ｃ－Ｒ１引物特异性验证逡逑Ｍ：Ｄ邋２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，邋２：ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３－６：实验室所筛金黄色葡萄球菌，７：阴性逡逑Ｆｉｇ．邋３－１邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｎｕｃ－￥＼／ｎｕｃ－Ｋ＼逡逑Ｍ：Ｄ邋２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，邋２：邋ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３－６：邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ邋／ｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｏｕｒ逡逑ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，邋７：ｎａｇｅｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ逡逑图３－２邋ｍ／ｃ－Ｆｌ／／ｗｃ－Ｒｌ引物特异性验证逡逑Ｍ：Ｄ２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，２：ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３：实验室所筛金黄色葡萄球菌，４：大肠杆l#５：沙门氏菌，逡逑６：产气杆菌，７：单增李斯特菌，８：表皮葡萄球菌，９：阴性逡逑Ｆｉｇ．邋３－２邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｎｕｃ－￥＼／ｎｕｃ－Ｋ＼逡逑Ｍ：Ｄ２０００，邋１邋：ＡＴＣＣ邋２５９２３，邋２：ＣＭＣＣ邋２６００３，邋３：邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ邋ｉｓｏｌａｔｅｄ邋ｂｙ邋ｏｕｒ邋ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ邋，逡逑２２逡逑

金黄色葡萄球菌,产气杆菌,实验室,阴性

金黄色葡萄球菌,聚合酶,条带,产气杆菌

显示出特异扩增的目标条带，大小与理论目标值一致，空白对照和其它常逡逑见食源性致病菌株的基因组ＤＮＡ，未出现非特异性扩增条带，由此说明引物特异性逡逑强，而且条带清晰明量，故选择作为后续实验所用引物，见图３－３。逡逑图３－３脚Ａ－Ｆ１／Ｗ＿Ｍ－Ｒ１引物特异性验证逡逑Ｍ：Ｄ２０００，邋１，７：ＡＴＣＣ邋１９１１５，２：邋ＡＴＣＣ邋１９１１１，３：ＡＴＣＣ邋１５３１３，邋５：ＡＴＣＣ邋７６４４，邋６：ＣＩＣＣ邋２１６３３，邋４：逡逑阴性，８：金黄色葡萄球菌，９：沙门氏菌，１０：大肠杆菌，１１：产气杆菌，１２：表皮葡萄球菌．１３：空肠弯曲杆逡逑菌逡逑Ｆｉｇ．邋３－３邋Ｔｈｅ邋ｒｅｓｕｌｔ邋ｏｆ邋ＰＣＲ邋ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｈｌｙＡ－ＹＭｈｌｙＡ－Ｋ＼逡逑Ｍ：Ｄ２０００，邋１，７：ＡＴＣＣ邋１９１１５，２：邋ＡＴＣＣ邋１９１１１，邋３：邋ＡＴＣＣ邋１５３１３，邋５：ＡＴＣＣ邋７６４４，邋６：ＣＩＣＣ邋２１６３３，邋４：逡逑ｎｅｇａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｔｒｏｌ，邋８：邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｃｏｃｕｓ邋ａｕｒｅｕｓ，邋９：邋Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ邋ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ，邋１０：邋Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ邋ｃｏｌｉ，邋１１：逡逑Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒ邋ａｅｒｏｇｅｎｅｓ，邋１２：邋Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ邋ｅｐｉｄｅｒｍｉｄｉｓ，邋１３：邋Ｃｍｎｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ邋ｊｅｊｕｎｉ逡逑３．２优化重组聚合酶恒温扩增结果逡逑３．２．１重组酶聚合酶扩增金黄色葡萄球菌优化结果逡逑在不同温度和时间条件下应用ＲＰＡ扩增＃黄色葡萄球菌，结果表明ＲＰＡ在逡逑３０°Ｃ－４５°Ｃ均可以扩增金黄色葡萄球菌

【参考文献】