糖基化反应对花生过敏原Ara h 1致敏性的影响及机理研究

发布时间：2020-08-11 18:13

【摘要】：花生过敏影响全世界约5%的儿童和1.4~2%的成人的健康,是人类健康的重大威胁之一,其中Ara h 1是花生主要过敏原之一。已有的研究显示热处理会改变花生的致敏性,实验室前期研究结果表明,水煮和油炸会导致花生致敏性降低,而烘烤处理可以使花生致敏性升高,推测烘烤时发生的糖基化反应影响了花生过敏原的致敏性。故本文以花生Ara h 1蛋白为研究对象,原核表达重组Ara h 1蛋白,用干热法模拟糖基化反应获取终末糖基化Ara h 1蛋白,并分析了干热处理导致Ara h 1蛋白结构的改变;进一步以BALB/c小鼠和RBL细胞为致敏性评估模型综合评估糖基化对花生Ara h 1致敏性的影响;并在此基础上研究了糖基化修饰影响Ara h 1致敏性的机理,揭示了糖基化修饰对过敏原在过敏反应的各个阶段产生的影响。主要研究内容和结论如下:1重组花生Ara h 1蛋白和糖基化Ara h 1蛋白的获取提取花生总RNA,反转录为cDNA,PCR扩增得到Ara h 1基因序列,将该序列克隆至pET-28a载体中,构建Ara h 1-pET-28a表达载体,进行验证和测序,将测序成功的质粒转入Rosetta(DE3)表达宿主菌中诱导表达,将以包涵体形式表达的重组蛋白溶解后透析复性,镍柱纯化获取重组蛋白,经质谱鉴定为重组花生Ara h 1蛋白(R-Ara h 1)。用干热处理模拟糖基化反应,随处理时间增长蛋白中游离氨基含量减少、结合糖含量增多,有果糖胺和高荧光水平小分子产生,推测有糖基化反应发生,质谱检测和ELISA结果表明,在100℃干热处60min后有终末糖基化特征结构产生,表明获取了终末糖基化Ara h 1蛋白(AGE-Ara h 1)。2糖基化修饰对重组花生Ara h 1蛋白致敏性影响的研究用BALB/c小鼠和RBL细胞致敏性评估模型分别研究了糖基化修饰的重组花生Ara h 1蛋白的致敏性。用AGE-Ara h 1蛋白以皮下注射的方式免疫BALB/c小鼠,结果表明与对照R-Ara h 1相比,AGE-Ara h 1致敏的小鼠体重增长率较低,脾脏质量分数较高,空肠和肺出现了更严重的炎性浸润和充血现象,腹腔灌洗液中的肥大细胞和嗜碱性粒细胞有更高程度的脱颗粒现象;此外小鼠血清中有更高含量Th2型细胞因子(IL-4、IL-5、IL-13)、特异性抗体(IgE、IgG)和组胺,小肠和肺中有更高水平的TSLP基因表达,表明糖基化组小鼠体内有更严重的Th2型过敏反应;RBL细胞实验表明,AGE-Ara h 1致敏的小鼠血清有更高的使RBL脱颗粒能力。综上所述,AGE-Ara h 1致敏性更高,即糖基化修饰上调了R-Ara h 1蛋白的致敏性。3糖基化反应上调花生Ara h 1蛋白致敏性的机理研究本文通过模拟胃液消化实验、IgE结合力实验和树突细胞、RBL细胞模型分析了糖基化反应对重组Ara h 1蛋白在过敏反应不同阶段产生的影响,结果表明糖基化修饰使花生Ara h 1抗消化能力上升;树突细胞对糖基化Ara h 1有更高的摄取能力,且糖基化Ara h 1可上调树突细胞RAGE表达和IL-10释放;最后虽然糖基化使Ara h 1与IgE的结合能力略有下降,但增加了使RBL细胞脱颗粒的能力,进而引发更严重的过敏反应。
【学位授予单位】：上海大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R155
【图文】：

花生,过敏原,复合物,组织相容性复合物

肥大细胞活化，介质释放和症状表现(图1-1)[8]。花生被摄入后，花生过敏原可以穿过肠粘膜，进入人体的内环境。抗原呈递细胞(antigen presenting cell，APCs)如巨噬细胞、树突细胞或 B 淋巴细胞通过内吞作用或吞噬作用摄取这些过敏原。一旦这些过敏原被内化，它们就会被降解成寡肽并与主要的组织相容性复合物 II 类(MHC II)结合，形成MHC II 类肽复合物。随后复合物被转移至细胞表面，与 T 细胞受体(TCR)识别，抗原信息被呈递给 CD4+T 细胞，该阶段称为抗原呈递。研究表明，MHC II 类肽复合物和 TCR 之间的亲和力较低

花生,完整性,离子,蛋白

g 离心 30 min，取上清 10 μL 于 C18，3μm，250mm×75mm。1.0 谱中选 10 个强度最高的离子进行行检索。被时 R-Ara h 1 蛋白和 AGE-A0μL；一抗为稀释 500 倍的 CEL 抗建提取取花生总 RNA，结果见图 2-1，提取的 RNA 完整性较好，基本

花生,载体,菌落生长,白斑

图 2-2 花生 Ara h 1 基因的克隆Figure 2-2 Clone of Ara h 1 gene构建的 Arah1-pMD-19T 载体转化入 DH5α 大肠杆菌中，可以看al 的 LB 平板上有白色菌落生长(图 2-3)，挑取白斑进行通用引1、4、5 号单菌落经 PCR 扩增后在 2000bp 附近有明显条带，表因插入 pMD-19T 载体中。

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