副溶血性弧菌检测方法的建立及评价

发布时间：2020-08-13 11:24

【摘要】：研究目的:由食源性致病菌引发的食品安全问题属于严重的公共卫生问题,而副溶血性弧菌是我国重点监控的食源性致病菌之一。目前对副溶血性弧菌的检测方法多存在操作复杂费时等问题,且因食品样品组分复杂,难以达到灵敏检测要求。因此建立快速、准确、灵敏的副溶血性弧菌检测方法,对预防和控制由副溶血性弧菌污染引发的食品安全问题十分必要。本论文旨在构建灵敏度高、准确性好的副溶血性弧菌检测方法,并对所建立的检测方法进行评价,论文的研究工作可为食品中食源性致病菌的监测提供一定的理论依据和检测新方法,并为确保我国食品安全提供一定的技术支撑。研究方法:本论文建立了两种新的副溶血性弧菌检测方法。1.基于免疫磁分离技术可视化检测副溶血性弧菌。该方法通过免疫磁分离技术富集分离副溶血性弧菌,利用二氧化锰纳米探针特异性结合副溶血性弧菌,形成免疫磁珠-副溶血性弧菌-二氧化锰纳米探针复合物。再在外加磁场下分离,利用抗坏血酸对磁分离产物进行消解。当待检样品中含有副溶血性弧菌时,二氧化锰纳米探针会与磁富集得到的副溶血性弧菌特异性结合,经抗坏血酸还原作用产生大量的锰离子,锰离子使金纳米粒子聚集,金纳米溶液呈蓝色;反之,当待检样品中无副溶血性弧菌时,二氧化锰纳米探针被洗去,金纳米溶液呈分散状态下的红色。据此实现对待检样品中副溶血性弧菌的快速可视化检测;2.基于分子印迹技术检测副溶血性弧菌。该方法以副溶血性弧菌为模板,以聚二甲基硅氧烷聚合物,制备印迹聚合物薄膜,采用化学气相沉积法在制备的印迹聚合物薄膜表面修饰含氟硅烷化物层。通过印迹聚合物薄膜与副溶血性弧菌的特异性结合,实现对副溶血性弧菌的快速、高效富集分离。进一步用煮沸法提取已捕获的副溶血性弧菌DNA,进行聚合酶链式反应(PCR),实现对待检样品中副溶血性弧菌的快速准确检测。研究结果:1.基于免疫磁分离技术可视化检测副溶血性弧菌。该方法在最佳检测条件下,副溶血性弧菌浓度在10~10~6 CFU·mL~(-1)范围内,金纳米溶液在525 nm处的吸光度与副溶血性弧菌浓度对数呈线性关系,线性方程为A_(norm)=-0.128 lg N+0.893(R~2=0.997),检测限为10 CFU·mL~(-1),相对标准偏差为6.48%~9.65%(n=3),加标回收率在95.78%~101.83%之间。研究结果表明该方法特异性评价实验结果良好。应用该方法检测蛤蜊样品,副溶血性弧菌的测定范围为10~10~6 CFU·mL~(-1)。该方法在45 min内可完成检测,裸眼即可判读结果,能够满足对副溶血性弧菌的快速检测要求;2.基于分子印迹技术检测副溶血性弧菌。原子力显微镜表征结果显示,获得的印迹聚合物空腔在空间和结合位点上与副溶血性弧菌的尺寸和形态完全匹配。当富集时间为2 h时,印迹聚合物薄膜对副溶血性弧菌的富集可达3.7×10~7CFU·mL~(-1)。该方法对副溶血性弧菌的测定范围为10~4~10~8 CFU·mL~(-1),检测限为10~4CFU·mL~(-1),特异性评价实验结果良好,已用于蛤蜊样品检测,副溶血性弧菌的测定范围为10~4~10~8 CFU·mL~(-1),结果满意。研究结论:1.基于免疫磁分离技术检测副溶血性弧菌,结合了免疫磁珠的高效富集和金纳米的灵敏信号放大,无需增菌过程。2.基于分子印迹技术检测副溶血性弧菌,提出了一种新型的印迹聚合物薄膜,通过在聚二甲基硅氧烷表面修饰含氟硅烷化物层,提高了印迹聚合物薄膜对副溶血性弧菌的选择性。3.成功建立了两种副溶血性弧菌检测方法,即基于免疫磁分离技术和基于分子印迹技术检测副溶血性弧菌,并对检测效果进行评价,两种检测方法特异性好、灵敏度高、成本低且操作简单、快速。4.两种检测方法相互补充,具有较宽的测定范围,且分别适用于不同的检测场景,便于在基层检测工作中普及应用。
【学位授予单位】：吉林大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R155.5

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