【摘要】：目的本实验建立巨噬细胞-成纤维细胞体外模型,将纳米二氧化硅刺激的THP-1源性巨噬细胞上清作用于MRC-5,通过蛋白质组学方法检测MRC-5蛋白表达水平变化,探讨纳米二氧化硅对MRC-5蛋白表达的影响,为探索人体纳米二氧化硅暴露导致呼吸系统炎症反应和纤维化趋势的生物标志物提供依据。方法常规培养THP-1和MRC-5细胞。实验前预先用PMA将THP-1诱导成巨噬细胞。将THP-1源性巨噬细胞随机分为对照组和五个浓度梯度实验组,粉尘作用浓度分别为(0、6.25、12.5、25、50、100)μg/ml,作用时间为24h。MTT法检测细胞存活率,AnnexinV-FITC法检测细胞凋亡率,酶偶联比色法和TBA法分别检测细胞上清LDH和MDA水平。同样将MRC-5随机分为对照组和五个浓度梯度实验组,分别加入相应浓度处理组的巨噬细胞上清,作用时间为24h。MTT法检测细胞增值率,样本碱水解法检测细胞上清Hyp的分泌水平,阐述纳米二氧化硅对巨噬细胞及成纤维细胞的损伤作用,评价体外模型构建是否成功。选取巨噬细胞上清对MRC-5毒性作用最明显的一组,使用液相-质谱仪对该组和对照组细胞蛋白进行定性、定量分析,筛选两组间的差异蛋白。选取其中有代表性的蛋白经蛋白免疫印迹法验证差异性,评价质谱结果的可靠性。其中,对细胞存活率、增值率等常规实验均设立相同浓度梯度的微米二氧化硅处理组作为纳米作用强度的阳性对照,差异蛋白检测仅针对纳米二氧化硅实验组。结果1透射电镜结果显示,实验所用纳米颗粒粒径在20~50nm之间;粉尘粒度仪结果显示,无血清RMPI1640培养基中纳米颗粒轻微团聚,平均粒径为166.8nm。2倒置显微镜下观察,纳米组的巨噬细胞出现细胞变圆、细胞膜皱缩、胞质内产生空泡甚至破裂死亡等变化,随着粉尘浓度的升高,胞质内颗粒物沉积量增加,细胞贴壁状态变差。3 MTT法检测巨噬细胞的存活率:纳米组巨噬细胞存活率在粉尘浓度为6.25μg/ml时较对照组无统计学差异,其余各组均较对照组低(P0.05);与同浓度微米组相比,纳米组在粉尘浓度为6.25、12.5、25μg/ml时细胞存活率低(P0.05),其余各组无统计学差异。4 Annexin V-FITC法检测巨噬细胞凋亡水平:纳米组各剂量组细胞凋亡率较对照组均高(P0.05);与同浓度微米组相比,纳米组在粉尘浓度为6.25、25μg/ml时细胞凋亡率高(P0.05),其余各组无统计学差异。5酶偶联比色法检测细胞上清LDH分泌水平:纳米组巨噬细胞上清LDH含量在粉尘浓度为6.25μg/ml时较对照组无统计学差异,其余各组细胞上清LDH含量均较对照组高(P0.05);与同浓度微米组相比,纳米组在粉尘浓度为25、50、100μg/ml时巨噬细胞上清的LDH活力高(P0.05),其余各组无统计学差异。6 TBA法检测细胞上清MDA分泌水平:纳米组细胞上清MDA含量在粉尘浓度为6.25μg/ml时较对照组无统计学差异,其余组细胞上清MDA含量较对照组上升(P0.05);与同浓度微米组相比,纳米各处理组MDA活力差异均无统计学意义。7 MTT法检测MRC-5的增值率:纳米组在粉尘浓度为6.25μg/ml时细胞增值率较对照组无统计学差异,其余组细胞增值率较对照组高(P0.05);与同浓度微米组相比,纳米组在12.5μg/ml时细胞增值率高(P0.05),其余各组均无统计学差异。8样本碱水解法检测MRC-5上清Hyp的分泌水平::纳米组在粉尘浓度为6.25、12.5μg/ml时细胞上清Hyp含量与较照组无统计学差异,其余各组上清Hyp含量较对照组高(P0.05);与同浓度微米组相比,粉尘浓度为100μg/ml时纳米组MRC-5上清Hyp含量高(P0.05),其余各组差异无统计学意义。9液相-质谱仪检测差异蛋白,western-blot法检测差异蛋白:经检测分析,两组样品共检测蛋白质3174个,其中差异蛋白234个。差异蛋白主要富集在核糖体通路,参与调节细胞凋亡、生长与分化,监督蛋白正确折叠,对外源性刺激产生氧化应激反应等生物过程;选择表达上调的蛋白中与其他蛋白相互作用明显且有代表性的P4HB和HSP90B1蛋白进行验证差异蛋白的实验,结果显示,实验组两种目的蛋白较对照组表达均高(P0.05),验证了质谱结果的可靠性。结论1纳米二氧化硅可降低THP-1源性巨噬细胞的存活率,导致细胞损伤并发生凋亡作用,在相应浓度作用强度大于微米二氧化硅。2纳米二氧化硅作用于巨噬细胞诱发其分泌的细胞因子可引起MRC-5增值和Hyp分泌量增加,在相应浓度作用强度大于微米二氧化硅。3纳米二氧化硅作用于巨噬细胞诱发其分泌的细胞因子可引起MRC-5发生蛋白水平的改变,调控细胞凋亡、蛋白合成及细胞生长等生物过程。其中,SerpinB2蛋白可能是人体肺成纤维细胞暴露于纳米二氧化硅颗粒引起炎症反应和纤维化趋势的生物标志物。图10幅;表10个,参115篇。
【学位授予单位】：华北理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
【图文】：
图 1 纳米二氧化硅颗粒透射电镜图Fig.1 Transmission electron micrograph of nano-silica parti
图 2 纳米二氧化硅颗粒在无血清 RMPI1640 培养基中粒度分布图Fig. 2 Particle size distribution of nano-silica particles in serum-free RMPI1640 medium1.5.2 细胞形态学改变（1）THP-1 细胞状态良好时镜下呈大小均一，折光度好，透明无颗粒的圆形悬
A THP-1 细胞 B THP-1 源性巨噬细胞图 3 THP-1 细胞和 THP-1 源性巨噬细胞形态（×100）Fig. 3 THP-1 cells and THP-1 derived macrophage morphology（×100）
【参考文献】
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2799685
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