纳米氧化锌诱导人肺上皮细胞凋亡机制探索

发布时间：2020-08-25 04:27

【摘要】：纳米氧化锌(ZnO NPs)被广泛应用于工业、日用品、生物医学等领域,对人类健康的潜在安全性问题备受关注。研究表明,ZnO NPs可通过呼吸道、消化道等途径进入人体,还可经血循环到达身体其他组织器官,引发相应器官损伤。目前认为,ZnO NPs毒性效应机制主要是由其诱导氧化应激导致的,氧化应激可引发炎症、DNA损伤及细胞凋亡等。氧化应激也可引起靶细胞的应激反应,包括基因表达改变。然而,目前ZnO NPs关键响应基因认识并不全面。在本研究中,我们首先评价ZnO NPs对人肺泡上皮细胞A549的毒性效应。表征鉴定结果显示,我们实验用的ZnO NPs平均粒径为37.32nm,呈立体晶体状,分散性较好且稳定。利用CCK-8检测ZnO NPs作用于A549细胞后的相对细胞活力,结果显示,ZnO NPs对A549细胞显著抑制浓度为7.5 μg/mL,并且随着ZnO NPs浓度和时间的增加,细胞活力逐渐下降。此外,我们检测ZnO NPs作用于细胞后总活性氧(ROS)生成情况,发现ROS含量随ZnO NPs浓度增加呈现递增趋势,7.5 μg/mL引起ROS含量升高至对照组2倍。利用PI和Annexin V-FITC染色法检测ZnO NPs处理后细胞凋亡情况。结果显示,7.5 μg/mL的ZnO NPs引起Sub-G1期及Annexin V阳性细胞数显著增加,说明ZnO NPs处理引起细胞凋亡。mRNA翻译的调控在基因表达中发挥有重要作用,然而ZnO NPs对翻译的影响目前尚没有研究。于是,我们首先检测了 ZnO NPs作用于A549细胞后核糖体的分布情况,结果显示,ZnO NPs处理后多聚核糖体(翻译效率高)比例显著降低,而单核糖体(翻译效率低)比例显著增加,说明整体翻译水平被抑制。此外,我们检测ZnO NPs处理后翻译调控蛋白4EBP1、eIF2α的磷酸化修饰水平,发现4EBP1的磷酸化水平逐渐降低,eIF2α的磷酸化水平逐渐升高,进一步说明ZnO NPs抑制细胞mRNA翻译。活性氧清除剂NAC预处理后,ZnO NPs对细胞翻译的抑制效应得以恢复,说明ZnO NPs通过氧化应激抑制细胞整体翻译水平。随后,我们利用核糖体展示技术(Ribo-seq)筛选ZnONPs处理后翻译水平差异表达基因。以两倍变化为标准筛选到翻译水平差异表达基因2667个,其中2597个基因翻译下调,70个基因翻译上调。GO功能性分析发现翻译差异表达基因在生物学过程、细胞成分和分子功能中分别富集于细胞黏附、各种细胞膜成分和钙离子结合等。KEGG通路分析则发现差异表达基因主要富集于溶酶体、细胞外基质-受体相互作用以及各种信号通路如Notch、PI3K-Akt、Wnt等。STRING数据库聚簇分析发现,翻译表达上调基因主要集中在两个功能丰富的簇集上,一个是转录因子簇(包括FOS、FOSB、JUNB、EGR1等),另一个是核糖体蛋白簇(包括RPL22、RPL10、RPS27A 等)。我们进一步对ZnO NPs处理后核糖体蛋白簇中变化最为显著的RPL22进行验证。结果显示,ZnO NPs处理A549细胞后RPL22的蛋白水平上调,而mRNA水平没有明显变化,提示ZnO NPs在翻译水平促进RPL22表达。为明确核糖体蛋白RPL22在ZnO NPs诱导A549细胞凋亡中的作用,我们利用shRNA抑制内源RPL22表达后,检测细胞凋亡情况。结果表明,与对照组相比,敲降RPL22组Sub-G1期(凋亡细胞)细胞数显著减少,说明RPL22介导ZnO NPs促进的细胞凋亡。综上所述,本论文发现:1)ZnO NPs引起A549细胞活力降低、ROS升高和细胞凋亡;2)ZnO NPs抑制A549细胞翻译,降低蛋白质合成速率;3)ZnONPs处理A549细胞1小时可影响约3,000个mRNA的翻译,差异表达基因功能富集于细胞黏附、溶酶体等;4)ZnONPs影响包括RPL22在内的多个核糖体蛋白的翻译上调;5)核糖体蛋白RPL22介导ZnO NPs诱导的细胞凋亡。本论文首次系统研究ZnO NPs短时间作用对细胞翻译的影响,证明ZnO NPs引起的翻译改变参与其毒性效应。对差异基因功能的进一步深入研究将有助于阐明ZnO NPs毒性效应机制。
【学位授予单位】：浙江大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
【图文】：

一些研究认为ＺｎＯＮＰｓ释放的Ｚｎ２＋在其毒性中起到重要作用。当ＺｎＯＮＰｓ逡逑浓度低于Ｚｎ２＋最大溶解浓度时，细胞毒性主要由Ｚｎ２＋导致，当ＮＰｓ浓度超过Ｚｎ２＋逡逑最大溶解浓度时，未溶解的ＮＰｓ起毒性作用［２０］。如图１－１所示。逡逑Ｘ邋ＺｎＯ邋ＮＰ邋 ＂＊？邋Ｚｎ逡逑／邋ＶＬ逡逑［＼邋／逡逑Ｚｎ＞逦Ｖ—？邋［Ｚｎ２１１逦Ｉ逡逑Ｅｎｚｙｍｅｓ邋ｉ逦／逡逑ｎ．逦Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ邋NB邋Ｃａ２＊邋ｆｌｕｘ逡逑ｆａｃｔｏｒｓ邋ｌ逦ＲＯＳ邋ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ逡逑逦邋逦逦ｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｄａｍａｇｅ逡逑ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ邋ｄｙｓｆｕｎｃｔｉｏｎ逡逑图１－１．邋ＺｎＯ邋ＮＰｓ引起的细胞毒性机制｜２１］逡逑１．２邋ＺｎＯ邋ＮＰｓ对基因表徶的影响逡逑ＮＰｓ产生ＲＯＳ的途径主要通过自身结合０２产生0２＼活化或损伤线粒体、促逡逑进ＮＡＤＰＨ氧化酶表达［２２］等。正常情况下，细胞产生ＲＯＳ发挥包括调控细胞分逡逑裂、免疫应答等特定生理功能；过多则会损伤细胞内物质如蛋白质、ＤＮＡ等，从逡逑２逡逑

ｓｅｑ是近来发展起来的另一种翻译研究方法，能够有效监测翻译效率。通过将核糖逡逑体保护的ＲＮＡ片段分离并测序，识别正在翻译的转录本，以发现基因翻译调控的逡逑重要信息［３２］。如图１－２所示。逡逑Ｐｏｌｙｓｏｍｅ邋ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ逦Ｒｉｂｏｓｏｍｅ逦ｐｒｏｆｉｌｉｎｇ逡逑Ｉ邋ｎｒ邋＼逦＂＜＃８＾逦P常垮义希卞澹掊澹掊危掊义希遥危幔螅邋澹簦颍澹幔簦恚澹睿翦义襄危驽义希樱澹洌椋恚澹睿簦幔簦椋铮铄义希樱澹欤澹悖簦椋铮铄澹铮驽澹澹妫妫椋悖椋澹睿ィ辏螅椋�ｅ邋ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ逡逑ｔｒａｎｓｌａｔｅｄ邋ＲＮＡ邋ｖ逦＿邋ＲＰＦｓ邋ｆｒｏｍ邋ａｌｌ逡逑ＤＮＡ邋ｍｉｃｒｏａｒｒａｙ邋－逦＝邋ＲＮＡ逡逑ＲＮＡ－ｓｅｑ逦＾逡逑ＲＮＡ－ｓｅｑ逡逑图１－２．研究翻译效率的两种核糖体分析技术［３０丨逡逑本文以人肺上皮细胞Ａ５４９细胞为细胞模型，系统研究ＺｎＯ邋ＮＰｓ引起的翻译逡逑改变及意义。首先检测ＺｎＯ邋ＮＰｓ对整体翻译效率的影响；随后运用Ｒｉｂｏ－ｓｅｑ鉴定逡逑４逡�

本文编号：2803270