卤代苯醌类消毒副产物的细胞毒性和遗传毒性研究

发布时间：2020-08-28 03:03

【摘要】：饮用水氯化消毒必然会产生氯化消毒副产物(DBPs),卤代苯醌(HBQs)是近年来在饮用水检出的一类新型DBPs。前期研究表明HBQs的细胞毒性强于受控的卤乙酸和三卤甲烷,并能诱导细胞内活性氧自由基上升,从而导致细胞DNA损伤,提示HBQs有潜在遗传毒性。然而,现有研究对HBQs的毒理学评价仍不完善,缺乏对HBQs致基因位点突变、DNA损伤和染色体畸变等多个遗传学终点的综合评价。故本研究拟采用体外试验组合对HBQs的细胞毒性和遗传毒性进行研究,为将来HBQ的暴露风险评估及饮用水卫生标准修订提供科学数据。1 6种HBQs的细胞毒性研究目的:检测6种HBQs暴露于中国仓鼠卵巢细胞系细胞(CHO-K1)72h细胞毒性作用。方法:将1000个/孔细胞接种在96孔板中,培养24 h后,分别加入不同浓度的2,6-二氯-1,4-二氯苯醌(2,6-DCBQ)、2,5-二氯-1,4-二氯苯醌(2,5-DCBQ)、2,6-二溴-1,4-苯醌(2,6-DBBQ)、2,5-二溴-1,4-苯醌(2,5-DBBQ)、2,6-二碘-1,4-苯醌(2,6-DIBQ)和2,3-二碘-1,4-苯醌(2,3-DIBQ),并设0.5%DMSO为溶剂对照,染毒72 h后以酶标仪于450nm测定吸光度并计算细胞相对存活率(%)。结果:6种HBQs对CHO-K1细胞毒性顺位:2,3-DIBQ2,6-DIBQ2,6-DBBQ2,5-DBBQ2,5-DCBQ2,6-DCBQ。半数抑制剂量(IC_(50))数量级在10~-55 M;毒性较几乎所有卤代甲烷类DBPs毒性强、较绝大部分卤乙酸类毒性强,但比大部分卤乙腈类DBPs毒性弱;IC_(50)与摩尔表面积(S)具有显著相关性(P0.05),而与辛醇-水对数分配系数(logP)、最高已占轨道(E_(HOMO))、最低未占轨道(E_(LUMO))、偶极矩(μ)和摩尔折射率(R)无关(P0.05)。结论:HBQs对CHO-K1细胞毒性IC_(50)范围为14.61μM~31.90μM,其细胞毒性大小与物质的理化特性密切相关。2 6种HBQs的遗传毒性研究目的:采用HPRT基因突变法、单细胞凝胶电泳(SCGE)试验、胞质阻滞法微核(CBMN)试验评价6种HBQs对CHO-K1细胞的遗传毒性作用。方法:将1×10~6个CHO-K1细胞接种于100 mm皿中,正常培养24 h后,分别加入6种不同浓度HBQs,阴性对照为DMSO,阳性对照为甲基磺酸乙酯,处理4 h后回复培养20 h。收集细胞,采用HPRT基因突变法测定突变情况,加入5μg/mL 6-TG筛选突变体,计算突变率。CHO-K1细胞暴露于6种不同浓度HBQs,溶剂对照为DMSO,阳性对照为EMS,24 h后采用SCGE试验测定尾部DNA%、尾长和Olive尾距。加入5μg/mL细胞松弛素B和6种不同浓度HBQs对CHO-K1细胞同时进行染毒,并设溶剂对照(DMSO)和阳性对照(丝裂霉素C),染毒1.5-2个细胞周期后计算微核率、核桥率和核芽率,并分析遗传毒性大小与细胞毒性和理化结构参数的关系。结果:6种HBQs的突变率与溶剂对照相比较,差异均无统计学意义(P0.05)。随着2,6-DCBQ染毒剂量升高,10μM即可导致尾部DNA%和尾长显著增加(P0.05),15μM 2,6-DCBQ可引起Olive尾距值升高(P0.05);1μM 2,5-DCBQ即可导致尾部DNA%、尾长和Olive尾距值显著增加(P0.05)。但随着2,6-DCBQ和2,5-DCBQ染毒剂量升高,尾部DNA%、尾长和Olive尾距又呈下降趋势。其余4种HBQs SCGE试验结果呈阴性。2,6-DCBQ、2,6-DBBQ、2,6-DIBQ和2,5-DCBQ可导致微核率、核芽率和核桥率显著增加(P0.05),并随剂量增加呈剂量反应关系。其余2种HBQs CBMN试验结果呈阴性。遗传毒性大小顺位为:2,5-DCBQ2,6-DBBQ2,6-DIBQ2,6-DCBQ;HBQs的遗传毒性效能与其细胞毒性有相关性(P0.05);与摩尔折射率R、辛醇-水分配系数logP、摩尔表面积S、最高已占轨道E_(HOMO)、最低未占轨道E_(LUMO)、偶极矩μ无相关(P0.05)。结论:CHO-K1/HPRT基因突变试验表明6种HBQs无致突变性。CHO/SCGE试验表明2,6-DCBQ和2,5-DCBQ可能具有致DNA损伤的作用,未观察到其余4种HBQs有DNA损伤作用。CHO-K1/CBMN试验表明2,6-DCBQ、2,6-DBBQ、2,6-DIBQ和2,5-DCBQ具有染色体损伤作用,未观察到其余2种HBQs有染色体损伤作用。其遗传毒性顺位为2,5-DCBQ2,6-DBBQ2,6-DIBQ2,6-DCBQ;与HBQs的细胞毒性相关。结合三种遗传毒性试验结果表明HBQs为可疑遗传毒物。
【学位授予单位】：广西医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：R114
【图文】：

剂量-反应曲线,毒性,细胞的,消毒副产物

图 1-1 6 种 HBQs 染毒 72 h 后对 CHO-K1 细胞的毒性Figure 1-1 The cytotoxicity of six HBQs in CHO-K1 cells for 72 h表 1-1 HBQs 72 h 染毒后对 CHO-K1 细胞的影响HBQs 细胞毒性范围（μM） IC50（μM） R2细胞毒性排序2,3-DIBQ 0.6269 - 90.27 14.61 0.9850 12,6-DIBQ 0.8718 - 88.74 17.12 0.9745 22,6-DBBQ -1.262 80.38 21.58 0.9126 32,5-DBBQ 0.8275 86.5 24.82 0.9756 42,5-DCBQ 0.1976 81.75 26.39 0.9680 52,6-DCBQ 0.89 - 78.88 31.90 0.9920 6注：IC50表示与对照组比较，HBQs 引起半数细胞死亡的浓度；R2表示剂量-反应曲线的确定系数.2 四类 DBPs 对 CHO 细胞 72 h 毒性比较参考其它三类消毒副产物 72 h 暴露于 CHO 细胞产生的毒性作用，用

细胞集落,形成情况,集落形成率

细胞可形成边界清晰、肉眼清晰可见的类圆形集落（图2-1A），倒置显微镜低倍镜下观察每个集落均含 50 个以上的细胞（图 2-1B）。图 2-1 细胞集落形成情况A：六孔板中细胞集落形态；B：显微镜下细胞集落形态, ×40Figure 2-1 Colony formation of cellsA: Cells colony morphology in a six well plate; B: Colony morphology in microscope, ×402.2 未经 S9 活化的 6 种 HBQs 的细胞毒性在无 S9 情况下，6 种 HBQs 随着染毒剂量的升高，细胞集落形成数和相对集落形成率均逐渐下降，呈剂量-反应关系。6 种 HBQs 染毒组的相对集落形成率与阴性对照组比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。2,5-DBBQ和 2,3-DIBQ 能导致细胞相对集落形成率明显下降的最小浓度为 12.5 μM，2,6-DCBQ、2,6-DBBQ 和 2,6-DIBQ 则均为 25 μM，而 2,5-DCBQ 为 50 μM。

选择表,集落形成,情况,基因位点突变

图 2-2 选择表达后突变集落形成情况A：阴性对照 B：阳性对照Figure 2-2 Selection of mutant colonies after expressionA: Solvent control B: Positive control表 2-5 6 种 HBQs 对 HPRT 基因位点突变情况（-S9）HBQs 组别集落数（个）集落形成率（%）突变集落数（个）突变频率/2×16-DCBQ 阴性对照 130.8 ±7.56 65.40 ±3.78 0 ±0 0 ±0阳性对照 93.6 ±5.03 46.40 ±3.27 42.2 ±7.46 * 90.95 ±16.0825 μM 154.2 ±6.42 78.60 ±2.07 0 ±0 0 ±050 μM 140.2 ±8.44 69.60 ±3.71 0 ±0 0 ±075 μM 112.2 ±9.98 56.70 ±6.75 0 ±0 0 ±0100 μM 119.6 ±10.57 57.30 ±1.64 0 ±0 0 ±0

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