尼古丁对小鼠海马神经干细胞增殖、分化的影响及机制初探

发布时间：2020-09-19 17:48

　　 目的:尼古丁能够通过nAChR-α7调节神经干细胞发育,参与神经发生,同时由cAMP调节的鸟嘌呤核苷酸直接激活的交换因子(EPAC/cAMP-GEF)和PKA及其下游的信号分子也介导神经细胞增殖和分化、神经元轴突靶向生长。因此,我们研究尼古丁是否通过nAChR-α7介导EPAC及其相关信号分子的变化,从而调节神经干细胞(neural stem cells,NSCs)发育和神经形成,为尼古丁暴露引起的神经发育毒性提供合理的解释和寻找治疗的分子靶点。方法:1.用24小时内C57/BL6的新生小鼠,分离海马组织,培养原代小鼠海马NSCs,细胞传代至第3代第5天,进行免疫细胞化学染色,巢蛋白Nestin鉴定神经干细胞、SOX2标志物鉴定神经祖细胞、Ki-67检测NSCs增殖率;第3代NSCs诱导分化,培养5天,DCX、Tuj1、MAP2、GFAP和S100β抗体进行免疫细胞化学染色鉴定分化能力。2.LDH毒性检测法检测不同浓度尼古丁(1,10,100,200,300和400 μM)对NSCs的毒性作用;不同尼古丁浓度处理细胞,CCK-8法测定尼古丁对NSCs活力影响;碘化丙啶染色,流式细胞仪检测不同浓度尼古丁对NSCs细胞周期的影响;不同浓度尼古丁急性处理NSCs,提取蛋白,检测p-p38MAPK、p38MAPK、pERK、ERK、pAKT、AKT、nAChR-α7、EPAC1、EPAC2、PKA、Rap1、p-CREB和CREB蛋白表达。3.第3代NSCs诱导分化,尼古丁持续处理7天,DCX和GFAP免疫细胞化学染色检测尼古丁 10μM对NSCs分化能力的影响;提取蛋白,检测DCX和GFAP蛋白表达;分别用尼古丁、EPAC激动剂8-CPT、EPAC抑制剂ESI-09、PKA激动剂6-BNZ、PKA抑制剂H-89、ESI-09联合尼古丁以及H-89联合尼古丁条件处理细胞,DCX染色分析不同处理条件后DCX+神经元树突分支数和轴突长度;提取 mRNA,qRT-PCR 检测 nAChR-α7、EPC1、EPAC2、PKA 和 Rap1 mRNA 的表达。4.第3代NSCs诱导分化,分别用尼古丁 10μM、nAChR-α7特异性拮抗剂MLA 10μM以及MLA联合尼古丁处理6小时,提取蛋白检测nAChR-α7、EPC1、EPAC2、PKA和Rap1蛋白表达。结果:1.从小鼠海马组织中成功分离NSCs,每隔3天进行传代,细胞成球生长状态良好;第3代细胞Nestin和SOX2染色阳性,Ki-67阳性细胞占比49%,NSCs具有分化为神经元和星形胶质细胞的能力,DCX、Tuj1、MAP2、GFAP和S100β染色均呈阳性。2.尼古丁不同浓度(1,10,100,200,300和400μM)对NSCs无明显细胞毒性;尼古丁对细胞活性的影响有剂量效应,中等浓度(100和200μM)明显增加NSCs的细胞活性;尼古丁急性暴露促进小鼠海马NSCs增殖,p-p38 MAPK/p38 MAPK、pERK/ERK和pAKT/AKT明显上调,上调nAchR-α7表达,上调pCREB/CREB比率。3.NSCs诱导分化,尼古丁增加DCX+神经元细胞的数量,增加DCX蛋白表达,降低GFAP蛋白表达;尼古丁、EPAC和PKA激动剂降低神经元树突分支数,缩短轴突长度,而EPAC和PKA抑制剂增加神经元树突分支数和轴突长度;EPAC、PKA抑制剂联合尼古丁处理降低尼古丁对神经元形态可塑性的影响。4NSCs诱导分化,nAChR-α7特异性抑制剂(MLA)下调nAChR-α7蛋白表达,及尼古丁介导的下游EPAC/Rap1信号,但对PKA蛋白表达没有明显影响。结论:本研究说明了尼古丁对体外培养的NSCs增殖和分化均有影响。在增殖培养条件下,急性尼古丁暴露激活P38-MAPK、ERK和AKT信号通路,最终影响NSCs的增殖;在分化培养条件下,nAChR-α7特异性抑制剂下调nAChR-α7蛋白表达,及尼古丁介导的下游EPAC/Rap1信号,提示尼古丁通过nAChR-α7影响EPAC/Rap1信号的变化,促进早期神经元分化,影响神经元可塑性,减少神经元树突分支和降低轴突长度。图[12]表[0]参[52]
【学位单位】：安徽理工大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R114
【部分图文】：

图３邋：邋ＮＳＣｓ分化能力检测逡逑Ａ：未成熟神经元标记物ＤＣＸ染色；逡逑Ｂ：成熟神经元标记物ＭＡＰ２染色；逡逑Ｃ：ＧＦＡＰ

图４：不同浓度尼古丁暴露对ＮＳＣｓ的细胞毒性和增殖的影响逡逑

图５：尼古丁暴露对ＮＳＣｓ细胞周期的影响逡逑Ａ：对照组；逡逑Ｂ：尼古丁邋ｌ邋ｐＭ处理组；逡逑

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本文编号：2822823