埃克替尼在矽肺纤维化进展中的体外干预作用

发布时间：2017-04-02 19:04

  本文关键词：埃克替尼在矽肺纤维化进展中的体外干预作用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的观察埃克替尼对二氧化硅(SiO2)致肺上皮细胞间质转化中E钙粘蛋白(E-cadherin)、α-平滑肌激动蛋白(α-SMA)表达的影响,并探讨表皮生长因子受体(EGFR)信号通路在肺纤维化上皮间质转化中的作用。 方法采用体外制备矽肺细胞模型方法,用50ug/ml的SiO2粉尘刺激肺泡巨噬细胞(AM),分别作用3、6、12、18、24、36h后收集上清液,用ELISA方法检测上清中TGF-β1蛋白的表达,并以TGF-β1表达的高峰时间点(Tm)的AM培养上清作为条件培养上清。用终浓度分别为0(对照组)、50、100、200ug/ml的SiO2粉尘与AM培养上清液(Tm)共同刺激肺上皮细胞,作用48h后,用埃克替尼干预染尘肺上皮细胞,实验分组：正常对照组(N组,SiO2粉尘浓度为Oug/ml)、模型组(F组,SiO2粉尘浓度为200ug/ml).低剂量干预组(A1组,SiO2粉尘浓度为200ug/ml+埃克替尼浓度20umol/L)、中剂量干预组(A2组,SiO2粉尘浓度为200ug/ml+埃克替尼浓度40umol/L)、高剂量干预组(A3组,SiO2粉尘浓度为200ug/ml+埃克替尼浓度80umol/L),干预48h后,于倒置光学显微镜观察细胞形态学改变,并收集不同时段细胞,用RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA、EGFR mRNA表达水平,细胞免疫荧光方法检测E-cadherin、α-SMA及EGFR蛋白表达的变化。 结果染尘组AM培养上清液中TGF-β1蛋白的表达在各时间点均明显高于对照组,且随作用时间的延长呈先升高后降低的趋势,18h水平最高,差异具有统计学意义(P0.05)。倒置显微镜观察肺上皮细胞经SiO2处理后细胞形态出现间质细胞特点,由鹅卵石状转变为纺锤型或梭型,伪足样改变,似成纤维细胞,SiO2浓度为200ug/ml时最明显；埃克替尼干预48h后,进展停滞,纤维状伪足变短,呈类圆形。体外细胞染尘,随着SiO2浓度的升高,E-cadherin mRNA和蛋白表达逐渐下调,在200ug/ml组表达最低,α-SMA、EGFR mRNA和蛋白表达逐渐上调,200ug/ml组α-SMA表达最高；实验组50、100、200ug/ml与对照组的差异具有统计学意义(P0.05)。埃克替尼干预后,E-cadherin mRNA阳蛋白表达无明显变化,F组、A1组、A2组、A3组之间差异无统计学意义(P0.05),与N组之间差异显著(P0.05)；α-SMA mRNA和蛋白表达明显下调,信号转导蛋白EGFR mRNA和蛋白表达逐渐下调,各组之间差异具有统计学学意义(P0.05)。 结论SiO2体外刺激AM,使TGF-β1蛋白表达水平明显升高,呈时间-效应关系,上清液与SiO2可共同诱导肺上皮细胞向间质细胞转化,其机制可能与EGFR信号通路有关。埃克替尼能抑制上皮间质转化,其机制可能与下调α-SMA表达和抑制EGFR活性有关。由此我们推测,抑制EGFR信号通路的活化可能为临床治疗肺纤维化提供新的思路和途径。
【关键词】：埃克替尼 二氧化硅 EGFR 上皮间质转化 矽肺
【学位授予单位】：青岛大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R135.2
【目录】：

• 摘要2-4
• Abstract4-8
• 引言8-9
• 第一章 试剂及仪器9-11
• 1.1 细胞来源9
• 1.2 试剂及耗材9-10
• 1.3 仪器10-11
• 第二章 方法11-20
• 2.1 实验器具的处理11
• 2.2 试剂的配置11-12
• 2.2.1 磷酸盐缓冲液PBS溶液的配制11
• 2.2.2 细胞冻存液的配制11
• 2.2.3 10%DMEM培养液的配制11
• 2.2.4 10%山羊血清配置11
• 2.2.5 0.3%TritionX-100溶液的配制11
• 2.2.6 4%多聚甲醛溶液的配制11
• 2.2.7 一抗稀释液的配置11
• 2.2.8 辣根酶标记二抗稀释液的配置11-12
• 2.2.9 75%乙醇配置12
• 2.2.10 二氧化硅(SiO_2)的配置12
• 2.2.11 埃克替尼溶液的配置12
• 2.3 细胞的培养12-13
• 2.3.1 细胞复苏12
• 2.3.2 细胞传代12-13
• 2.3.3 细胞计数法13
• 2.3.4 细胞冻存13
• 2.4 矽肺细胞模型制备13-15
• 2.4.1 AM条件培养上清液的制备14
• 2.4.2 肺上皮细胞染尘14-15
• 2.5 光学显微镜下观察细胞的形态学变化15
• 2.6 实时荧光定量PCR (RT-PCR)检测A549细胞E-cadherin、α-SMA、EGFR mRNA的表达15-18
• 2.6.1 检测染尘肺上皮细胞E-cadherin、α-SMA、EGFR mRNA的表达15
• 2.6.2 检测埃克替尼干预染尘肺上皮细胞后E-cadherin、α-SMA、EGFR mRNA的表达15-16
• 2.6.3 Trizol法提取细胞总RNA16
• 2.6.4 RNA纯度与浓度的测定16
• 2.6.5 逆转录反应cDNA的合成16-17
• 2.6.6 PCR扩增17-18
• 2.7 细胞免疫荧光法检测E-cadherin、α-SMA、EGFR蛋白表达的影响18-19
• 2.7.1 实验分组18
• 2.7.2 细胞免疫荧光步骤18-19
• 2.8 统计学处理19-20
• 第三章 实验结果20-29
• 3.1 ELISA方法检测SiO_2刺激AM培养上清液中TGF-β1表达变化20
• 3.2 倒置相差显微镜下A549细胞形态学观察20-22
• 3.3 RT-PCR检测E-cadherin、α-SMA、EGFR mRNA的表达结果22-26
• 3.3.1 染尘肺上皮细胞E-cadherin、α-SMA、EGFR mRNA的表达22
• 3.3.2 埃克替尼对染尘肺上皮细胞E-cadherin、α-SMA、EGFR mRNA的表达水平的影响22-26
• 3.4 细胞免疫荧光法检测E-cadherin、α-SMA、EGFR蛋白表达结果26-29
• 第四章 讨论29-34
• 第五章 结论34-35
• 参考文献35-39
• 综述39-58
• 综述参考文献50-58
• 攻读学位期间成果58-59
• 致谢59-60

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前7条

1 李理;李伟峰;蔡琳;袁伟锋;黄文杰;;吉非替尼对博莱霉素致肺纤维化小鼠α平滑肌肌动蛋白的抑制作用[J];南方医科大学学报;2010年12期

2 吴浩，张月娥，许祖德，张锦生，杜卫东，，朱虹光，陈琦;血小板源性生长因子对肺纤维母细胞前胶原合成的影响[J];上海医科大学学报;1996年03期

3 吴健虹;谢秋玲;陈小佳;洪岸;;表皮生长因子受体EGFR及其信号传导[J];生命科学;2006年02期

4 蔡琳;李理;方春生;冯娟;余永红;石茗;;EGFR对博莱霉素诱导小鼠肺纤维化中上皮-间质转分化的影响[J];现代生物医学进展;2012年04期

5 李伟峰;李理;袁伟锋;黄文杰;;吉非替尼抑制博莱霉素诱导的小鼠肺纤维化[J];中国病理生理杂志;2010年08期

6 蔡琳;吴壮;徐军;;博莱霉素诱导α平滑肌肌动蛋白Cre重组酶转基因小鼠肺纤维化上皮细胞-间质转分化的研究[J];中国呼吸与危重监护杂志;2009年01期

7 Makoto Nakamuta;Kazuhiro Kotoh;Munechika Enjoji;Hajime Nawata;;Effects of fibril- or fixed-collagen on matrix metalloproteinase-1 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase-1 production in the human hepatocyte cell line HLE[J];World Journal of Gastroenterology;2005年15期

  本文关键词：埃克替尼在矽肺纤维化进展中的体外干预作用，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：282986