MAPK蛋白家族在百草枯诱导肺泡上皮—间充质转化（EMT）中的作用机制

发布时间：2020-09-30 01:46

　　目的本研究通过建立体外大鼠II型肺泡上皮细胞(RLE-6TN),运用相关分子生物学技术,观察百草枯(paraquat,PQ)是否能诱导RLE-6TN细胞发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)现象;探讨MAPK蛋白家族是否参与PQ致肺泡上皮细胞EMT;最后阐明JNK/AP-1信号转导通路在百草枯诱导肺泡上皮细胞间充质转化中的调控机制。方法建立大鼠II型肺泡上皮细胞(RLE-6TN)体外模型1.探求PQ对RLE-6TN细胞损害的剂量效应关系和时间效应关系。以终浓度为0、25、50、100、200、300、400μmol/L PQ染毒细胞24h,CCK-8法检测细胞存活率,观察不同浓度PQ对细胞的损伤程度;使用终浓度200μmol/L PQ处理细胞12、24、36、48、60、72h,CCK-8法检测细胞存活率,观察PQ在不同时间点对细胞的损伤程度;以200μmol/L PQ处理细胞不同时间(12、24、36h),运用流式细胞仪Annexin V-FITC法检测细胞凋亡;PI单染法检测细胞周期。2.观察不同浓度或不同时间PQ染毒RLE-6TN细胞后,细胞形态、细胞的生物行为学和上皮/间质标志物表达变化的情况。以200μmol/L PQ处理细胞不同时间(12、24、36h),细胞划痕实验检测细胞迁移能力;Transwell小室法检测细胞侵袭能力;免疫荧光检测细胞上皮/间质标志物蛋白表达改变。以终浓度为0、25、50、100μmol/L PQ染毒细胞不同时间(6、12、24h),运用免疫印迹检测上皮细胞标志物E-cad、ZO-1和间质标志物蛋白α-SMA、Vimentin的表达水平。3.为了观察PQ染毒对MAPK蛋白家族的关键蛋白的影响,将RLE-6TN细胞分成五组:正常对照组(control)、100μmol/L PQ染毒组、100μmol/L PQ与p38MAPK抑制剂联合干预组、100μmol/L PQ与JNK抑制剂联合干预组、100μmol/L PQ与Erk抑制剂联合干预组。运用免疫印迹检测p38MAPK、JNK、Erk1/2蛋白表达及磷酸化表达水平变化。4.探讨JNK/AP-1信号通路是否参与了PQ诱导RLE-6TN细胞发生的EMT。终浓度0、100、200、300μmol/L PQ诱导RLE-6TN细胞24 h,运用免疫印迹检测JNK/AP-1信号通路关键蛋白JNK、c-jun、c-fos及其磷酸化蛋白p-JNK、p-c-jun、p-c-fos表达的变化;采用双荧光素酶报告基因检测PQ诱导RLE-6TN细胞中AP-1转录活性。5.寻找JNK/AP-1信号通路的有效靶点,探讨JNK抑制剂SP600125能否成为PQ中毒致纤维化治疗的新靶点。将10μmol/L SP600125在加入PQ前孵育细胞2h,通过CCK-8筛选对细胞无损害的浓度剂量,运用免疫印迹检测细胞p-JNK表达水平来判断是否有效抑制JNK磷酸化水平。使用流式细胞仪Annexin V-FITC法检测干预前后细胞凋亡的改变;细胞划痕实验检测干预前后细胞迁移能力;运用免疫印迹检测细胞干预前后JNK/AP-1信号通路的相关蛋白表达水平,并检测上皮细胞标志物E-cad、ZO-1和间质标志物α-SMA、Vimentin的表达水平;采用RT-PCR检测干预前后细胞的MMP-2、MMP-9、TIMP-1、COL-I、COL-III mRNA表达水平。结果(1)与对照组比较,RLE-6TN细胞存活率随着PQ剂量和时间的增加明显降低(P0.05),呈剂量和时间依赖性。与对照组比较,以200μmol/L PQ诱导RLE-6TN细胞12、24、36h,细胞凋亡率下降(P0.05),细胞周期阻滞在S期(P0.05);(2)与对照组比较,以200μmol/L PQ诱导RLE-6TN细胞12、24、36h,细胞形态表现为卵圆形、连接紧密的上皮细胞向纺锤状梭形、连接松散的间质细胞转变;RLE-6TN细胞的迁移能力增强(P0.05);RLE-6TN细胞的侵袭能力增强(P0.05);上皮标志物E-cad荧光强度减弱,间质标志物FSP-1荧光强度增加;以终浓度为0、25、50、100μmol/L PQ染毒细胞6、12、24h,上皮细胞标记蛋白E-cad、ZO-1表达下调,间质标志物蛋白α-SMA、Vimentin的表达上调(P0.05);(3)与对照组比较,100μmol/L PQ诱导细胞24h后,RLE-6TN细胞p-p38MAPK、p-JNK、p-Erk1/2蛋白表达明显上调(P0.05)。与PQ诱导组比较,干预组(分别用p38MAPK特异抑制剂SB203580、JNK特异抑制剂SP600125、Erk特异抑制剂PD98059)各10μmol/L预处理1h,100μmol/L PQ处理24h)的上述蛋白磷酸化水平均明显降低(P0.05)。(4)与对照组比较,PQ能够诱导p-JNK、p-c-jun、p-c-fos蛋白表达明显上调(P0.05);染毒组的AP-1转录激活较对照组显著增强(P0.05);(5)1、10μmol/L SP600125组的细胞存活率下降不明显(P0.05),100μmol/L组能明显的抑制细胞增殖活性(P0.05),10μmol/L SP600125组在诱导细胞2h后吸出继续培养12、24h,该组细胞存活率下降不明显(P0.05),10μmol/L SP600125组在诱导细胞2h后吸出继续培养36h,能明显的抑制细胞增殖活性(P0.05);10μmol/L SP600125组能够明显抑制PQ诱导的JNK蛋白磷酸化水平;与染毒组比较,在12、24、36h时间点,干预组的细胞存活率明显降低(P0.05),在48h时间点,干预组的存活率无明显变化(P0.05);与PQ染毒组相比,干预组凋亡降低,但差异并无统计学意义(P0.05),干预组细胞迁移能力明显降低(P0.05);与染毒组比较,干预组能够有效抑制p-JNK、p-c-jun、p-c-fos蛋白表达(P0.05);与染毒组相比,干预组的上皮标志物表达明显升高(P0.05),而间质标志物表达明显降低(P0.05);与染毒组比较,干预组的COL-1和COL-III mRNA表达显著降低(P0.05),另外两大成分基质金属蛋白酶MMP-2/MMP-9 mRNA表达也明显降低(P0.05),TIMP1mRNA表达也明显升高(P0.05)结论MAPK信号通路的激活在PQ诱导RLE-6TN细胞发生EMT中发挥重要作用;JNK作为JNK/AP-1信号通路的上游靶点执行了EMT进程;SP600125可能是治疗PQ中毒致逆转EMT的关键靶点。
【学位单位】：宁夏医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R114
【部分图文】：

细胞生长曲线,肺泡上皮细胞,存活率,细胞存活率

108h 之后到达平台期，细胞死亡数量逐渐增加，第 144h 出现细胞接触抑制现象(图1A)。正常 RLE-6TN 细胞表现为由卵圆形、连接紧密的上皮细胞(图 1-1B)。2.2 PQ 诱导 RLE-6TN 细胞增殖活性降低CCK-8 结果显示，不同终浓度 PQ(0、25、50、100、200、300、400μmol/L)处理细胞 24h，细胞存活率随着染毒浓度的增加而下降，与对照组比较，50、100、200、300、400 μmol/L PQ 染毒组的细胞存活率明显下降，差异有统计学意义(P<0.05)（图 1-2A）。说明 PQ 对 RLE-6TN 细胞的损伤具有剂量依赖性(r=㧟0.953)，染毒浓度越大，对细胞的损伤越强。以 200 μmol/LPQ 处理细胞不同时间(12、24、36、48、60、72h)，细胞存活率随染毒时间的增加而下降，与对照组比较，PQ 染毒 24、36、48、60、72h 细胞存活率明显下降(P<0.05)。提示随着染毒时间的延长，PQ 对 RLE-6TN 细胞的毒性增强(r=㧟0.921)(图1-2B)。图 1-1 正常的 RLE-6TN 细胞生长曲线及形态学特征注：A:RLE-6TN 细胞生长曲线；B:RLE-6TN 细胞形态学特征(×200)

细胞生长曲线,细胞周期,细胞存活率,细胞的

细胞形态,细胞迁移,划痕

2.2 PQ 诱导 RLE-6TN 细胞迁移能力增强采用细胞划痕实验检测 PQ 对 RLE-6TN 细胞迁移能力的影响。结果显示，与组比较，200μmol/LPQ 诱导组的细胞迁移能力明显增强(图 2-2A)，尤其是 24h 诱导细胞划痕明显变窄、36h 诱导组的细胞划痕基本被迁移过来的细胞所覆盖，而对照划痕则明显存在，且这种改变具有统计学意义(P<0.05)(图 2-2B)。提示随着 PQ 诱导的延长，RLE-6TN 细胞的迁移能力增强。

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