血红素加氧酶-1在纳米氧化锌致内皮细胞炎性反应中的作用

发布时间：2020-10-30 12:30

　　 背景及目的纳米氧化锌(zinc oxide nanoparticles,ZnO-NPs)的广泛应用增加了职业人群在生产、运输和使用中的暴露机会。ZnO-NPs可通过多种途径(呼吸道、消化道和皮肤渗透等)进入机体,随后被转运至循环系统,并随血液流动迁移、蓄积,进而诱导血管系统发生炎症。血管内皮细胞功能障碍可以导致多种心血管疾病的发生发展,而ZnO-NPs能否导致血管内皮细胞损伤而诱导血管系统炎症尚存争议,仍需进一步研究。血红素加氧酶-1(heme oxygenase,HO-1)可催化血红素降解为胆红素、亚铁离子和一氧化碳,具有抗氧化、抗凋亡、抗炎等功能,然而HO-1在ZnO-NPs诱导的内皮细胞炎性中的作用尚未研究,有待进一步探索。为探究ZnO-NPs能否诱导内皮细胞炎性反应以及HO-1在该过程中的作用,本课题在体外实验水平上,探究ZnO-NPs对内皮细胞EA.hy 926的脂质过氧化作用及炎性反应,并通过调节HO-1的表达水平,进一步探讨HO-1在ZnO-NPs致炎反应中的作用,为研究ZnO-NPs对机体的心血管毒性作用提供理论依据。方法1.ZnO-NPs(质量浓度0、2.5、5、10、15、20、25、30、40μg/mL)作用于EA.hy 926细胞24 h,CCK 8法测定ZnO-NPs对EA.hy 926细胞活性的影响。2.分别以0、2.5、5、10、15μg/mL的ZnO-NPs处理EA.hy 926细胞,采用试剂盒检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平、总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性、丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量以反映细胞脂质过氧化水平,使用RT-PCR方法检测细胞内IL-6、IL-1β、VEGF、MCP-1、HO-1 mRNA表达水平,ELISA方法检测细胞分泌的IL-1β、VEGF蛋白表达水平,Western Blot方法检测细胞内HO-1蛋白表达水平。3.使用HO-1激活剂钴原卟啉(protoporphyrin IX cobalt chloride,CoPPIX)和HO-1抑制剂锌原卟啉(protoporphyrin IX zinc,ZnPPIX)分别预处理细胞1 h后,以15μg/mL的ZnO-NPs对EA.hy 926细胞进行染毒,检测细胞HO-1表达水平、ROS水平、SOD活性、MDA含量及IL-1β、VEGF蛋白表达水平。结果1.ZnO-NPs对EA.hy 926细胞活性的影响与对照组相比,当ZnO-NPs浓度达到10μg/mL时,细胞活性显著降低,随着ZnO-NPs浓度的增加,细胞活性呈逐渐降低的趋势。ZnO-NPs浓度为15μg/mL时,细胞活性为63.18%,而在20μg/mL时,细胞活性为46.07%。2.ZnO-NPs对EA.hy 926细胞的脂质过氧化作用与对照组细胞内ROS表达水平相比,染毒剂量5μg/mL、10μg/mL及15μg/mL组细胞ROS水平均有增高,差异具有统计学意义(P0.05)。与对照组细胞SOD活性相比,5μg/mL、10μg/mL及15μg/mL染毒组差异具有统计学意义(P0.05),10μg/mL及15μg/mL染毒组细胞的MDA含量与对照相比,差异具有统计学意义(P0.05)。随着染毒剂量的增加,细胞内ROS水平升高,MDA生成增多,SOD活性逐渐降低,MDA/SOD比值升高,细胞发生脂质过氧化作用。3.ZnO-NPs对EA.hy 926细胞的炎性作用ZnO-NPs处理细胞12 h后,细胞内IL-1β、IL-6、VEGF、MCP-1 mRNA表达量相比对照组均有不同程度的升高,分泌的IL-1β、VEGF蛋白水平升高,差异具有统计学意义(P0.05)。4.ZnO-NPs对EA.hy 926细胞HO-1表达水平的影响在无应激情况下,HO-1 mRNA及蛋白表达水平较低,随着ZnO-NPs刺激剂量的增加,细胞内HO-1相对表达水平随之升高。与对照组相比较,10、15μg/mL ZnO-NPs染毒组HO-1 mRNA及HO-1蛋白表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05);与10μg/mL组相比较,15μg/mL组HO-1表达水平升高,差异具有统计学意义(P0.05)。5.改变细胞HO-1水平对细胞炎性的影响5.1激活HO-1表达对细胞的影响CoPPIX处理后,细胞HO-1表达水平显著增高,CoPPIX+ZnO-NPs组相比于ZnO-NPs组,ROS水平、MDA含量及MDA/SOD比值明显下降,SOD活性明显增加,差异均具有统计学意义(P0.05)。CoPPIX+ZnO-NPs组相比于ZnO-NPs组,细胞分泌的IL-1β水平明显下降,VEGF水平明显增加,差异均具有统计学意义(P0.05)。5.2抑制HO-1表达对细胞的影响ZnPPIX处理后,细胞内HO-1表达水平明显降低,ZnPPIX+ZnO-NPs组相比于ZnO-NPs组,ROS水平、MDA含量及MDA/SOD比值明显升高,差异均具有统计学意义(P0.05),而SOD活性差异无统计学意义(P=0.50)。ZnPPIX+ZnO-NPs组相比于ZnO-NPs组,IL-1β水平明显升高,VEGF水平明显降低,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论1.10、15μg/mL的ZnO-NPs可以诱导EA.hy 926细胞发生脂质过氧化作用及炎性反应。2.HO-1激活可以减轻ZnO-NPs所致的EA.hy 926细胞炎性反应。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【部分图文】：

ZnO-NPs对EA.hy926细胞活性的影响

ZnO-NPs对EA.hy926细胞ROS表达水平影响的荧光图（40×）

ZnO-NPs对EA.hy926细胞ROS表达水平影响的流式细胞图
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本文编号：2862479