大气PM2.5对斑马鱼胚胎的心脏发育毒性及叶酸的保护机制

发布时间：2020-11-04 15:34

　　 目的:流行病学调查显示大气PM2.5与心脏发育疾病相关,动物实验也表明其导致心脏畸形,但目前分子机制尚不明确。我们以斑马鱼胚胎为研究模型,研究PM2.5有机提取物(extractable organic matter,EOM)的心脏发育毒性及叶酸(Follic Acid,FA)的保护作用,并从Ahr和Wnt/β-catenin信号通路的相互作用及DNA甲基化调控角度深入研究其分子机制。方法:(1)PM2.5收集:收集苏州市区PM2.5,分析其成分并用索氏提取法提取有机组分。(2)整体胚胎实验:取不同浓度的EOM对斑马鱼胚胎染毒,并给予Ahr抑制剂CH223191(CH)和β-catenin激活剂CHIR99021(CHIR),在体视显微镜下观察72hpf时斑马鱼胚胎的发育情况,主要包括胚胎孵化率、心率、心脏畸形率;以qPCR检测Ahr和Wnt/β-catenin通路相关基因mRNA的表达;以Western Blot检测β-catenin蛋白的表达;以EROD实验检测Cyp1a1活性。(3)分离心脏实验:用5mg/L浓度的EOM染毒斑马鱼胚胎,同时补充0.05μM叶酸,在体视显微镜下观察72hpf时不同处理组的斑马鱼胚胎发育情况。分离出胚胎心脏,用qPCR和荧光显微镜检测分离心脏的纯度;以qPCR检测不同处理组心脏中Ahr和Wnt/β-catenin通路及DNA甲基化相关基因mRNA的表达;以Western Blot检测心脏中Ahr和β-catenin的蛋白表达水平;以COBRA检测c-fos基因启动子区甲基化水平;以EROD检测Cyp1a1活性。结果:(1)EOM引起斑马鱼胚胎心脏畸形升高和心率下降,Ahr抑制剂CH和Wnt激活剂CHIR能拮抗EOM引起的心脏缺陷;EOM可以导致Ahr靶基因(Cyp1a1、Cyp1b1和Ahrra)表达的升高,降低β-catenin靶基因(Axin2,Nkx2.5和Sox9b)的表达,同时能降低Rspo2基因(β-catenin的上游基因)的表达;补充CH/CHIR能减轻EOM导致的大部分基因表达改变并引起Ahrrb(Ahr抑制基因)的表达升高。(2)补充叶酸降低EOM导致的斑马鱼心脏畸形,并且Ahr抑制剂CH和Wnt激活剂CHIR都提高了叶酸的保护效率。对于Ahr和Wnt/β-catenin信号通路相关基因,EOM在分离的心脏中引起类似于全胚胎中的mRNA表达变化。EOM还引起DNA甲基化修饰相关基因mRNA表达异常以及DNA甲基化变化,补充叶酸则有拮抗作用。特别是EOM所致分离心脏中c-fos基因启动子区DNA高甲基化和mRNA低表达在补充叶酸后均得到显著改善。EROD实验进一步验证了叶酸抑制EOM对Cyp1a1的激活。此外,叶酸还拮抗EOM所引起的β-catenin和Ahr蛋白表达改变。结论:EOM能够激活斑马鱼胚胎心脏中Ahr活性,并抑制Wnt/β-catenin信号通路,从而导致心脏发育畸形;叶酸可能通过稳定DNA甲基化拮抗EOM引起的Ahr和Wnt/β-catenin信号通路变化。我们的研究提示叶酸可用于防治大气PM2.5引起的先天性心脏疾病。
【学位单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【部分图文】：

PM2.5主要成分分布

图 1.2 CH/CHIR 对 EOM 所致斑马鱼胚胎心脏畸形的影响(n=4)（图A. 斑马鱼胚胎图片，箭头表示心脏畸形。0、0.2、1、5代表EOM的浓度（mg/L）B. 不同药物处理的斑马鱼胚胎心脏畸形率统计； CH:CH223191；CHIR:CHIR99021;CCHIR的浓度分别为0. 5和1μM不同字母代表有统计学差异。）

补充CH/CHIR前后暴露于EOM中斑马鱼胚胎的心率和孵化率(n=4)
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本文编号：2870276