矽肺大鼠噬菌体单链抗体库构建与矽肺相关抗体筛选

发布时间：2020-11-05 07:19

　　 背景和目的大量研究表明矽肺病的发生发展过程与机体免疫功能的变化密切相关,包括非特异性免疫、体液免疫、细胞免疫等均发挥了重要作用。矽尘是一种半抗原,可有选择地吸附体内物质组成复合抗原,巨噬细胞损伤或凋亡释放的脂蛋白等可成为自身抗原,因此尘肺的肺组织具有复杂的抗原成分。国内外学者均观察到矽肺病患者机体体液免疫功能明显增强,而矽肺患者细胞免疫功能大多降低。以往研究表明,接尘工人、矽肺患者体内存在病理情况下才出现的的抗体即自身抗体,但由于技术限制,仅对某一或某些抗体进行了检测,对某些期别、某个阶段的抗体进行了探讨,尚缺乏对矽肺病免疫抗体改变的全谱、全程、系统的观察研究。随着近年来细胞免疫学、分子免疫学技术的快速发展,抗体库技术越来越成熟,为探讨矽肺免疫抗体在尘肺的发生发展中的作用提供了新的途径和方法。噬菌体展示技术是以噬菌体外壳蛋白PⅢ或PⅧ基因为载体,在噬菌体中插入一段需要表达的基因片段,该外源基因片段可以在噬菌体表面PⅢ或PⅧ蛋白N末端形成一定的空间构象表达相应的蛋白。利用随机短肽与丝状噬菌体的表面蛋白PⅢ融合,并展示在噬菌体表面,首次建立了噬菌体随机肽库以来,噬菌体展示技术运用已经相当成熟,关于人源尘肺病噬菌体单链抗体库构建课题组前期已经成功构建,筛选出了几种煤工尘肺相关抗原抗体,并验证了其在接尘工人和煤工尘肺病患者血液中的表达,考虑到煤工尘肺患者接触的为混合性粉尘,且人群免疫反应较为复杂,影响因素较多,采用单一性二氧化硅粉尘构建大鼠矽肺模型,建立相对较为特异的矽肺噬菌体单链抗体库并从中筛选出矽肺相关抗体具有重要意义。方法1.构建大鼠矽肺模型:对大鼠进行二氧化硅悬液肺灌注,采用非气管暴露法经口间断注入二氧化硅悬液1ml(含SiO2100mg),注意观察其活动状态,灌注完成后轻抚大鼠胸部使粉尘分散至全肺,并使大鼠尽快解除窒息,以相同方法灌注1ml生理盐水作为对照组。分别在3、6、9、12周每个时间点实验组和对照组各处死6只,取组织样本和外周血备用。2.扩增单链抗体基因:提取矽肺模型构建成功的大鼠外周血,用大鼠外周血淋巴细胞分离液提取淋巴细胞,triozl法提取单核细胞总rna,用逆转录试剂盒反转录合成cdna。采用兼并引物经pcr扩增抗体轻重链可变区基因,使用带有粘端的linker将轻重链可变区连接成单链抗体。3.构建噬菌体单链抗体库:将单链抗体和噬菌粒载体pcantab-5e进行双酶切后进行拼接,然后转染感受态大肠杆菌tg1,经辅助噬菌体超感染,最终构建成大鼠矽肺噬菌体单链抗体库。4.对大鼠矽肺噬菌体单链抗体库富集筛选:提取模型大鼠肺组织蛋白和对照组肺组织蛋白,对已构建好的噬菌体单链抗体库进行4轮富集筛选,测定其库容量。5.矽肺噬菌体单链抗体特异性检测:随机选取最后一轮筛选后抗性平板上菌落20个,提取质粒包被在酶标板中,elisa检测矽肺大鼠(p)和对照组(n)肺组织蛋白od450值,以p/n2.0为阳性克隆。6.对阳性克隆鉴定:将阳性克隆质粒进行测序,测序结果在ncbi网站中进行blast比对,然后将测序结果翻译成蛋白质氨基酸序列并对翻译结果进行分析。结果1.利用噬菌体展示技术成功构建了库容量为7.2×109cfu/l的初级噬菌体单链抗体库。2.以提取的矽肺模型肺组织蛋白为靶蛋白,利用噬菌体展示技术,经4轮富集筛选,成功筛选出具有较高亲和力的抗矽肺大鼠的噬菌体单链抗体库,通过elisa方法,并经核酸测序及blast比对,从中筛选出3个大鼠矽肺模型相关抗体,分别是抗ifn-γ单链抗体,抗il-2r单链抗体和抗核糖体p蛋白单链抗体。结论利用噬菌体展示技术和基因工程技术,构建了库容量为7.2×109cfu/L的初级矽肺大鼠噬菌体单链抗体库,通过筛选初步确定了3个特异性单链抗体并进行了测序鉴定,分别是抗IFN-γ单链抗体,抗IL-2R单链抗体和抗核糖体P蛋白单链抗体。
【学位单位】：郑州大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2016
【中图分类】：R135.2
【文章目录】：
中文摘要
Abstract
中英文缩略词表
1 前言
2 材料和方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验动物
        2.1.2 菌株与载体
        2.1.3 主要试剂
        2.1.4 主要实验仪器
        2.1.5 主要试剂溶液配制
        2.1.6 PCR引物设计合成
    2.2 实验方法
        2.2.1 矽肺大鼠模型构建及外周血单核细胞RNA提取和cDNA文库构建
        2.2.2 PCR扩增轻重链可变区基因
        2.2.3 Linker连接肽合成和酶促磷酸化粘端
        2.2.4 VH+Linker+VL（Sc Fv）制备
        2.2.5 合成重组质粒与转化感受态大肠杆菌TG1
        2.2.6 转化后质粒提取及特异性鉴定
        2.2.7 大鼠矽肺噬菌体单链抗体库富集筛选
        2.2.8 Elisa法鉴定阳性克隆
        2.2.9 阳性克隆噬菌体提取及测序鉴定
3 结果
    3.1 矽肺模型大鼠外周血总RNA提取及逆转录结果
    3.2 抗体可变区扩增结果
    3.3 单链抗体ScFv合成结果
    3.4 辅助噬菌体（M13K07）扩增结果
    3.5 噬菌体抗体库构建结果及鉴定
    3.6 大鼠矽肺噬菌体单链抗体库富集筛选结果
    3.7 阳性克隆质粒特异性检测及测序鉴定结果
4 讨论
    4.1 噬菌体抗体库
    4.2 抗体库的库容量与多样性
    4.3 筛选出的抗体与矽肺的关系
        4.3.1 抗IFN-γ 抗体与矽肺的关系
        4.3.2 抗IL-2R抗体与矽肺的关系
        4.3.3 抗核糖体P蛋白抗体与矽肺的关系
5 结论
6 参考文献
综述
    参考文献
个人简历
致谢

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本文编号：2871310