研究目的通过动物实验研究BPA对其诱导的IR小鼠肝脏损伤,以及肝脏GSK3β相关蛋白活性的影响,并用GSK3β抑制剂下调GSK3β活性,探讨GSK3β在BPA诱导IR小鼠肝脏炎性损伤中的调控作用,为制定环境中BPA暴露危害的防治措施和策略提供实验依据。研究方法SPF4周龄雄性C57BL/6J野生型小鼠72只,饲养于SPF级环境,自由进食。将小鼠随机分为NCD组、NCD+GSK3β抑制剂组、HFD组、HFD+GSK3β抑制剂组、HFD+1000 nmol/L BPA组、HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组,NCD代表正常饮食,HFD组代表高脂饮食,喂养8周和16周。BPA用DMSO(终浓度不超过1%)溶解,配成1000nmol/L的浓度,通过饮水摄入。GSK3β抑制剂在第6~8周和14~16周经腹腔注射21.5mg/kg的GSK3β抑制剂Li Cl溶液,隔天1次,连续10天。每周记录1次小鼠饮水量、饲料消耗量和体重。8周和16周时,测定FG、检测FI以及评定IR指数;进行ITT测试和GTT测试;每组分别麻醉颈椎脱臼处死小鼠6只,进行眼球取血,检测血清中AST、ALT的水平;计算肝脏系数;采用HE法观察小鼠肝脏组织病理学改变;采用IHC法检测肝脏IL-1β、TNF-α、IL-6的表达水平;采用WB法检测小鼠肝脏组织中GSK3β、p-GSK3β(Ser9)蛋白和胰岛素通路相关蛋白表达水平。结果1小鼠一般情况实验期间,各组小鼠一般状态良好。不同时间点,各组小鼠日平均饮水量和食物消耗量差异无统计学意义。2 GSK3β抑制剂对BPA诱导小鼠体重和肝脏系数改变的影响2.1 BPA诱导小鼠体重及肝脏系数增加与NCD组相比,不同时间点HFD组小鼠体重均升高,从第10周起差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD组相比,HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠体重从第14周起增长显著,差异具有统计学意义(P0.05)。与NCD组相比,8周和16周时HFD组小鼠肝脏系数显著升高,差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD组相比,HFD+1000 nmol/L BPA暴露组小鼠肝脏系数在16周时显著上升,差异具有统计学意义(P0.05)。2.2 GSK3β抑制剂对BPA诱导小鼠体重和肝脏系数增加的影响与HFD组相比,HFD+GSK3β抑制剂组小鼠体重均下降,从第15周开始差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD+1000 nmol/L BPA组相比,HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠体重在第7、8周及第15、16周时明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD+1000nmol/L BPA组相比,HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠肝脏系数在16周时明显下降,差异具有统计学意义(P0.05)。3 GSK3β抑制剂对BPA诱导小鼠IR的影响3.1 BPA暴露对小鼠FG和FI及HOMA-IR的影响与NCD组相比,8周和16周时HFD组小鼠FG明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD组相比,HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠FG在16周时明显升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。与HFD组相比,8周和16周时HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠FI水平显著增加,且16周比8周更加明显,差异均具有统计学意义(P0.05)。与NCD组相比,8周和16周时HFD组HOMA-IR明显升高,具有统计学差异(P0.05)。与HFD组相比,HFD+1000 nmol/L BPA组HOMA-IR在16周时明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。3.2 GSK3β抑制剂对BPA暴露诱导小鼠FG、FI及HOMA-IR改变的影响与HFD组相比,8周和16周时HFD+GSK3β抑制剂组小鼠FG明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD+1000 nmol/L BPA组相比,HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠FG在16周时显著降低,差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD组相比,HFD+GSK3β抑制剂组小鼠FI水平在16周时明显降低。与HFD+1000 nmol/L BPA组相比,HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠FI水平在16周时明显降低,差异均具有统计学意义(P0.05)。与HFD组相比,8周和16周时HFD+GSK3β抑制剂组小鼠HOMA-IR明显降低,16周比8周更加明显,差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD+1000 nmol/L BPA组相比,HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠HOMA-IR在16周时明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。3.3 BPA暴露对小鼠GTT和ITT的影响GTT曲线下面积(Area under curve,AUC)显示,与NCD组相比,8周和16周时HFD组小鼠GTT的AUC明显升高。与HFD组相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA组小鼠GTT的AUC明显升高,16周比8周更加明显,差异具有统计学意义(P0.05)。ITT的AUC显示,与NCD组相比,8周和16周时HFD组小鼠ITT的AUC明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD组相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA组小鼠ITT的AUC明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。3.4 GSK3β抑制剂对BPA诱导小鼠GTT和ITT改变的影响经腹腔注射葡萄糖溶液后,GTT的AUC显示,与HFD+1000nmol/L BPA组小鼠相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠GTT的AUC显著下降,差异具有统计学意义(P0.05)。胰岛素经腹腔注入小鼠体内后,ITT的AUC显示,与HFD+1000nmol/L BPA组小鼠相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠ITT的AUC显著下降,差异具有统计学意义(P0.05)。4 GSK3β抑制剂对BPA诱导IR小鼠肝脏炎性损伤的影响4.1 BPA暴露对小鼠肝脏损伤的影响肝功能结果显示,与HFD组相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA组血清中AST和ALT水平明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。肝脏组织病理学结果显示,与NCD组比,8周和16周时HFD组小鼠肝脏组织病理改变加重。与HFD组相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA组小鼠肝脏组织病变更为严重。4.2 GSK3β抑制剂对BPA暴露小鼠肝脏损伤的影响肝功能结果显示,与HFD组相比,HFD+GSK3β抑制剂组小鼠血清中AST和ALT水平在16周时显著下降。与HFD+1000nmol/L BPA组相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠血清AST、ALT水平明显降低,差异具有统计学意义(P0.05)。肝脏组织病理学结果显示,与HFD组相比,8周和16周时HFD+GSK3β抑制剂组小鼠肝脏组织病理改变显著缓解。与HFD+1000nmol/L BPA组相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠肝脏病变明显改善。4.3 BPA暴露对小鼠肝脏组织炎症因子的影响与NCD组相比,8周和16周时HFD组小鼠肝脏组织中TNF-α、IL-1β、IL-6表达明显增强。与HFD组相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA组小鼠肝脏组织中TNF-α、IL-1β、IL-6表达均显著上升,差异具有统计学意义(P0.05)。4.4 GSK3β抑制剂对BPA暴露小鼠肝脏组织炎症因子的影响与HFD组相比,8周和16周时HFD+GSK3β抑制剂组小鼠肝脏组织IL-1β表达在8周和16周时均显著降低,TNF-α、IL-6表达在16周时显著降低。与HFD+1000nmol/L BPA组相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠肝脏TNF-α、IL-1β、IL-6表达明显下降,且16周比8周更加明显,差异具有统计学意义(P0.05)。5 GSK3β抑制剂对BPA诱导IR小鼠肝脏GSK3β、p-GSK3β及胰岛素信号通路蛋白表达的影响5.1 BPA暴露对小鼠肝脏GSK3β、p-GSK3β及胰岛素信号通路蛋白表达的影响与NCD组相比,8周和16周时HFD组小鼠肝脏p-GSK3β表达明显降低。与HFD组相比,8周和16周时HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠肝脏p-GSK3β表达显著下降,差异具有统计学意义(P0.05)。与NCD组相比,8周和16周时HFD组小鼠肝脏p-IRS1、p-PI3K、p-AKT表达明显下降。与HFD组相比,8周和16周时HFD+1000 nmol/L BPA组小鼠肝脏p-IRS1、p-PI3K、p-AKT蛋白表达水平显著降低,差异均具有统计学意义(P0.05)。5.2 GSK3β抑制剂对BPA暴露小鼠肝脏GSK3β、p-GSK3β及胰岛素信号通路蛋白表达的影响与NCD组相比,8周和16周时NCD+GSK3β抑制剂组小鼠肝脏p-GSK3β表达明显下降。与HFD组相比,8周和16周时HFD+GSK3β抑制剂组小鼠肝脏p-GSK3β表达均比对照组显著升高。与HFD+1000nmol/L BPA组相比,8周和16周时HFD+1000nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠肝脏p-GSK3β表达明显升高,差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD组相比,8周和16周时HFD+GSK3β抑制剂组小鼠肝脏p-IRS1、p-PI3K、p-AKT表达水平均显著上升,差异具有统计学意义(P0.05)。与HFD+1000 nmol/L BPA组相比,8周和16周时HFD+1000 nmol/L BPA+GSK3β抑制剂组小鼠肝脏p-IRS1、p-PI3K、p-AKT含量明显升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论(1)低剂量BPA暴露可以加重诱导HFD小鼠IR和肝脏损伤发生。(2)低剂量BPA暴露可以引起其诱导的IR小鼠肝脏组织炎性细胞浸润增多和炎性因子表达上调,并可显著降低肝脏组织GSK3β-S9蛋白表达而导致GSK3β活化。(3)GSK3β抑制剂可上调BPA诱导的小鼠肝脏中GSK3β-S9水平从而导致GSK3β活性降低,可显著缓解BPA诱导的IR,并可改善BPA诱导的IR小鼠肝脏病理损伤、导致肝脏炎性细胞浸润减少和炎性因子表达降低。
【学位单位】：安徽医科大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：R114
【部分图文】：
膜放置在显影版中央，根据 Mark 的位置，吸取适量显影液（一般在 20~40μl 之间）涂于所需检测蛋白分子量条带处，进行显影操作，得出所需条带图像并进行保存。（9）蛋白条带处理：免疫蛋白印迹法所检测出的条带图像，可用 IPWIN32 软件分析各条带的光密度值，对条带进行定量，化为数值后对数值进行统计学分析。2.9 统计分析方法本研究的数据资料用 SPSS 17.0 统计学软件进行录入统计和分析，以 x s表示。多组间均数比较采用单因素方差分析（One-WayANOVA），组间比较采用 LSD检验；P<0.05 为差异有统计学意义。2.10 实验流程图
无统计学意义。见图 2、3。图 2 每只小鼠周平均饮食量（x s）Figure 2 Average weekly food intake per mouse（x s）
GSK3β抑制剂对小鼠体重的影响（x s）。与 NCD 组相比：*P<0.05；组相比：#P<0.05；与 HFD+1000nmBPA 组相比：△P <0.05。Effect of BPAand GSK3β inhibitor on body weight of mice（x s）. Compaup:*P<0.05; compared with HFD group:#P<0.05; compared with HFD+1000ngroup:△P<0.05.
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本文编号：
2871991
