镉通过ROS介导的氧化损伤诱导人肾小管上皮细胞凋亡的研究

发布时间：2020-11-10 12:11

【摘要】：为了研究镉(Cadmium,Cd)暴露对人肾小管上皮细胞(HK-2)的毒性作用,本研究使用CdCl_2胁迫体外培养的HK-2细胞,通过MTT实验、光镜观察、流式细胞术、荧光染色、彗星实验、Western Blot等实验方法,检测了CdCl_2对HK-2细胞氧化损伤及凋亡的影响;通过CdCl_2与NAC共处理HK-2细胞,以探究ROS在CdCl_2引起的HK-2细胞发生氧化损伤及凋亡中的作用。以及建立小鼠Cd中毒模型,检测小鼠肾脏组织中几种重要抗氧化酶的活性以及脂质过氧化物的含量,HE染色法观察肾脏组织显微结构的改变,同时统计小鼠肾脏系数。研究旨在探索Cd暴露对肾脏损伤的毒性机制,为预防重金属Cd中毒以及临床治疗提供理论依据。实验结果如下:1.体外实验发现,与对照组相比,CdCl_2处理显著降低了HK-2细胞的活力,呈现出明显的时间-剂量-效应关系;光学显微镜观察HK-2细胞的形态发现,CdCl_2处理后HK-2细胞逐渐皱缩、变圆、脱落;荧光显微镜观察及流式细胞术的结果显示,CdCl_2处理后HK-2细胞内ROS含量明显上升且线粒体膜电位下降;彗星实验及Western Blot结果显示,CdCl_2处理可导致HK-2细胞DNA断裂及γ-H2AX蛋白的表达量显著增加,说明CdCl_2引起了HK-2细胞DNA损伤,且与ROS的生成有关;而Hoechst染色结果也表明,HK-2细胞出现染色质凝聚、核固缩碎裂的现象;Western Blot实验结果显示,CdCl_2处理后caspase-3发生活化,说明Cd处理可以引起HK-2细胞线粒体损伤和凋亡。与CdCl_2处理组相比,NAC与CdCl_2共同处理可以减少细胞形态改变;抑制细胞内ROS产生;且减轻了DNA的损伤程度,缓解了细胞的凋亡情况,表明CdCl_2对HK-2细胞的毒性损伤与ROS有关。2.动物实验发现,与对照组相比,CdCl_2处理组的小鼠肾脏组织中GSH-Px和CAT的活性在19 d时明显降低;SOD活性在相同处理时间条件下,随着浓度的增加出现先升高后降低的趋势;MDA含量则呈现升高趋势;HE染色结果显示,肾小管上皮细胞出现颗粒变性,部分细胞脱落,或固缩坏死。结论:1.Cd能够引起ROS大量积累,从而引起HK-2细胞线粒体膜电位下降及DNA损伤等一系列氧化应激反应,并最终导致细胞发生凋亡,初步表明Cd可通过ROS介导的氧化损伤引起肾小管上皮细胞凋亡。2.Cd暴露可以破坏小鼠肾脏组织抗氧化酶系统活性,导致肾小管上皮细胞损伤甚至坏死,进一步证明氧化损伤可对肾小管上皮细胞产生毒性损伤。
【学位授予单位】：山西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：R114
【图文】：

本学位论文的实验设计

第二章 镉通过 ROS 累积引起 HK-2 细胞氧化损伤及凋亡2 结 果2.1 CdCl2对 HK-2 细胞活性的影响用不同浓度 CdCl2（0、30、60、90 μmol/L）处理 HK-2 细胞 24 h 或者用 60 μmol/L处理 HK-2 细胞不同时间（0、12、24、36、48 h）后，通过 MTT 实验检测 CdCl2对HK-2细胞活性的影响。结果表明，使用60、90 μmol/L CdCl2处理24 h或者用60 μmol/L处理 24、36 和 48 h 后，细胞活性显著降低（P<0.01），由图 2.1 可知，随着 CdCl2处理浓度的增大以及处理时间的延长 HK-2 细胞活性逐渐降低，并呈现时间-剂量-效应关系，说明 CdCl2胁迫可以抑制 HK-2 细胞的活性。

图 2.2 CdCl2处理后 HK-2 细胞形态的变化情况A：不同浓度 CdCl2条件处理下，HK-2 细胞 24 h 后的形态变化情况；B：60 μmol/L CdCl2处理不同时间后对 HK-2 细胞形态的影响。Fig 2.2 Morphological changes of HK-2 cells after CdCl2treatmentA: Morphological changes of HK-2 cells after 24 h treatment under different concentrations of CdCl2;B: Effects of 60 μmol/L CdCl2on the morphology of HK-2 cells after different time.2.3 CdCl2对 HK-2 细胞 ROS 水平的影响通过荧光显微镜观察 DCFH-DA 探针标记的绿色荧光信号发现，不同浓度的CdCl2处理细胞 24 h 后，30 μmol/L 浓度处理下观察到少量 ROS 荧光生成，且随着CdCl2浓度的增加，ROS 荧光信号逐渐增强，在 90 μmol/L 浓度条件下 ROS 荧光明显增强（图 2.3A）。同时流式细胞术检测到 ROS 的生成量在 60 μmol/L 浓度条件下显著升高（P＜0.01），在 90 μmol/L 浓度处理下 ROS 达到最大值（图 2.3 B），使用 500 μmol/L 的 NAC 与 60 μmol/L CdCl2共处理 24 h 后，发现 ROS 荧光信号较 60
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本文编号：2877914