p53介导的线粒体凋亡途径在氟致神经毒性中的作用

发布时间：2020-11-11 17:31

　　 本研究主要由以下三部分组成:第一部分发育期氟暴露损伤子代大鼠学习和记忆能力及其潜在机制的探讨目的:由于氟能穿过胎盘和血脑屏障在脑组织中蓄积,氟致神经系统发育毒性已经引起广泛的关注。有研究表明细胞凋亡在氟致神经毒性中发挥重要作用,但作为一条介导细胞凋亡的重要通路,p53介导的细胞凋亡途径是否参与其中尚不清楚。本研究旨在探讨氟化钠(sodium fluoride,NaF)发育期暴露对子代大鼠学习和记忆能力的影响及其潜在机制。方法:将30只清洁级成年SD(Sprague-Dawley)大鼠(雌雄各半)按性别随机分为对照组及氟暴露组(低剂量组和高剂量组),每组雌雄各5只。其中低剂量和高剂量氟暴露组分别给予含10 mg/L和50 mg/L NaF饮水,而对照组则给予饮用自来水(氟化物﹤1 mg/L)。两个月之后,将各组中的雌雄大鼠随机合笼(1:1)交配,成功受孕后的雌鼠分开单笼饲养,并继续给予相同的饮水条件,直至子代大鼠断奶。然后将断奶后的子代大鼠按照性别和分组给予与亲代相同饮水条件分笼饲养,直至子代大鼠出生后2个月。染毒结束后,每组随机挑选6只雌性子代大鼠并做好标记,采用Morris水迷宫实验评估子代大鼠学习和记忆能力,Western blot检测子代大鼠海马组织中SIRT1、p53(acetyl K379)和p53凋亡通路相关蛋白如p53、PUMA和cytochrome c(cyto c)的表达水平。结果:Morris水迷宫的实验结果表明,在定位航行实验(place navigation test,PNT)中,与同时间点的对照组相比,50 mg/L的NaF染毒剂量组子代大鼠在第三天和第四天逃避潜伏期显著长于对照组,且对照组与氟染毒组子代大鼠逃避潜伏期均随时间呈下降的趋势,50 mg/L的NaF染毒组逃避潜伏期显著长于对照组;在空间探索实验(spatial probe test,SPT)中,与对照组相比,50 mg/L的NaF染毒组子代大鼠穿环次数、目标象限的路程百分比和时间百分比均显著降低。以上结果表明,暴露50 mg/L的NaF可以损伤子代大鼠的学习和记忆能力。同时,Western blot结果显示,50mg/L的NaF可显著上调子代大鼠海马组织中p53、cleaved caspase-3、PUMA、cyto c、p53(acetyl K379)和SIRT1的蛋白表达水平。结论:氟的发育期暴露可显著损伤子代大鼠的学习和记忆能力,且激活其海马组织中p53介导的细胞凋亡通路,表明p53凋亡通路介导的细胞凋亡可能参与调控氟致子代大鼠的神经发育毒性,且SIRT1可能作为上游信号分子参与调控。第二部分氟化钠通过激活p53介导的线粒体凋亡通路诱导SH-SY5Y细胞凋亡目的:研究NaF是否诱导人神经母细胞瘤细胞(SH-SY5Y)发生细胞凋亡及p53介导的细胞凋亡通路在该过程中的作用,进一步阐明氟致神经毒性的分子机制。方法:首先通过CCK-8实验确定NaF染毒SH-SY5Y细胞的浓度。采用20mg/L、40 mg/L和60 mg/L的NaF染毒SH-SY5Y细胞24 h后,采用Hoechst33342染色观察细胞核的形态学改变和Annexin V–FITC/propidium iodide双染后流式细胞术检测SH-SY5Y细胞的凋亡率;采用Western blot检测p53和p53线粒体凋亡相关蛋白(包括PUMA、Bax、Bcl-2、cyto c、cleaved caspase-3和cleaved PARP)的表达水平;采用免疫荧光检测p53和Bax的线粒体转位以及cyto c的线粒体释放情况;采用p53转录活性抑制剂pifithrin-α预处理细胞1 h,接着采用60mg/L NaF处理细胞24 h后流式细胞术检测细胞的凋亡率和Western blot检测凋亡相关蛋白的表达水平。结果:CCK-8实验结果显示,与对照组相比,当NaF浓度为40 mg/L、50mg/L、60 mg/L和80 mg/L时,细胞活力显著降低(分别为84.84%,70.76%,52.31%和34.31%),故选择20 mg/L、40 mg/L和60 mg/L为NaF处理SH-SY5Y细胞的浓度。当采用20 mg/L、40 mg/L和60 mg/L的NaF处理SH-SY5Y细胞24h后,Hoechst 33342染色后显示细胞核碎裂和浓染、流式细胞术显示升高的细胞凋亡率和cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达水平上调均表明40 mg/L和60mg/L的NaF处理SH-SY5Y细胞24 h后可以诱导细胞发生凋亡。SH-SY5Y细胞暴露于60 mg/L的NaF 24 h后,p53及p53细胞凋亡通路相关蛋白PUMA和cyto c的表达水平显著增加,而Bcl-2的表达水平显著下降;同时,在SH-SY5Y细胞中,40 mg/L和60 mg/L的NaF可显著促进p53发生核转位,20 mg/L、40 mg/L和60 mg/L的NaF可显著促进Bax发生线粒体转位,而60 mg/L的NaF可以显著促进cyto c由线粒体释放至胞浆。采用p53转录活性抑制剂pifithrin-α干预可显著降低NaF诱导的细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的表达水平的增加。结论:一定浓度的NaF可以通过激活p53线粒体凋亡通路来诱导SH-SY5Y细胞凋亡,且p53线粒体通路依赖于p53的转录活性。因此,p53可能为预防和治疗氟诱导的神经毒性提供了一个潜在的靶标。第三部分SIRT1过表达和白藜芦醇可通过抑制p53乙酰化缓解氟化钠诱导的SH-SY5Y细胞凋亡目的:研究在诱导SH-SY5Y细胞凋亡的过程中,NaF对p53去乙酰化酶SIRT1的影响及SIRT1在该过程中的作用。方法:采用20 mg/L、40 mg/L和60 mg/L的NaF处理SH-SY5Y细胞24 h后利用SIRT1去乙酰化酶试剂盒检测SIRT1去乙酰化酶活性和Western blot检测p53(acetyl K382)和SIRT1蛋白表达水平;采用腺病毒过表达SIRT1 24 h,接着采用60 mg/L的NaF处理细胞24 h后,流式细胞术检测细胞凋亡率和Western blot检测蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-3、p53(acetyl K382)和p53的表达水平;采用60 mg/L的NaF处理细胞24 h前先用SIRT1激动剂白藜芦醇(resveratrol,RSV)预处理SH-SY5Y细胞2 h,染毒结束后采用Western blot检测蛋白cleaved PARP、cleaved caspase-3、p53(acetyl K382)和p53的表达水平。结果:60 mg/L的NaF可显著抑制SH-SY5Y细胞SIRT1去乙酰化酶活性,40mg/L和60 mg/L的NaF显著上调SIRT1和p53(acetyl K382)的表达水平;在SHSY5Y细胞中采用腺病毒过表达SIRT1能够显著改善NaF诱导的细胞凋亡和cleaved caspase-3、cleaved PARP和p53(acetyl K382)的上调表达情况;采用RSV干预SH-SY5Y细胞后能显著下调NaF诱导的cleaved caspase-3、cleaved PARP、p53(acetyl K382)和p53的蛋白水平。结论:NaF可通过抑制SIRT1去乙酰化酶活性上调p53(acetyl K382)水平,从而激活p53介导的线粒体凋亡通路诱导SHSY5Y细胞发生凋亡,且过表达SIRT1或者RSV干预均能部分逆转其诱导的细胞凋亡,表明SIRT1可作为p53的上游信号调控分子,参与调控NaF诱导SH-SY5Y细胞凋亡。因此,SIRT1可能为预防和治疗氟诱导的神经毒性提供是一个潜在的靶标和新思路。
【学位单位】：华中科技大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【部分图文】：

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文育期暴露对子代大鼠一般情况的影响各组雌鼠均能成功受孕，孕鼠一般情况良好，均无表然分娩，每窝仔鼠至少为 8只，对照组和 10 mg/L的 /L的 NaF 组偶见 1-2次死胎。各组子代大鼠生长发育和水量也均无异常。子代雌性大鼠体重均有增长，但各1-1，P > 0.05）。同时，如表 1-11所示，50 mg/L的 N脏和卵巢脏器系数显著小于对照组（P < 0.05），而甲对照组比较差异无统计学意义（P > 0.05）。

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文且自身没有暴露于 NaF 的雌性子代大鼠为对照组。分析 MWM 实验结果表明，如图 1-2 所示，在 PNT 中，与同时间点的对照组相比，50 mg/L 的 NaF 染毒剂量组子代大鼠在第三天和第四天逃避潜伏期显著长于对照组（P < 0.05，图 1-2A），且对照组与氟染毒组子代大鼠逃避潜伏期均随时间呈下降的趋势，50 mg/L 的NaF 染毒组逃避潜伏期显著长于对照组（P < 0.05，图 1-2A）；在 SPT 中，与对照组相比，50 mg/L 的 NaF 染毒组子代大鼠穿环次数、目标象限的路程百分比和时间百分比均显著降低（P < 0.05，图 1-2C-E）。以上结果表明，暴露 50 mg/L的 NaF可以损伤子代大鼠的学习和记忆能力。

华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文2.3 氟的发育期暴露激活子代大鼠海马组织 p53 凋亡通路本研究接下来研究氟的发育期暴露能否激活子代大鼠海马组织 p53 凋亡通路。MWM 实验结束后，将子代大鼠颈椎脱臼处死后立即取出海马组织。采用Western blot 检测 p53 凋亡通路相关蛋白的表达水平。结果如图 1-3 所示，与对照组相比，50 mg/L 的 NaF 可显著上调子代大鼠海马组织中的 p53、cyto c、PUMA和 cleaved caspase-3的蛋白表达水平（P < 0.05）。以上结果表明，氟的发育期暴露可激活子代大鼠海马组织 p53 凋亡通路，且细胞凋亡可能参与调控氟致子代大鼠学习和记忆能力损伤。
【参考文献】

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1 孙殿军,王丽华,姜树林,陈志,魏红联,沈雁峰;中国大陆地方性砷中毒病情与防治动态、现状的分析[J];中国地方病防治杂志;2002年02期

本文编号：2879511