低剂量重金属联合暴露所致神经突触重构损害及植物多酚类化合物的干预作用

发布时间：2020-11-15 11:23

　　 重金属铅、镉、砷和汞广泛存在于人类赖以生存的环境和食品中,同时它们也是世界卫生组织公布的公共卫生领域所关注的十大主要化学物中仅有的四种重金属,且是一般人群血液中能检测到的典型神经毒物。暴露于其中的某一单个重金属对人体的危害已被广泛研究,且发现对神经系统学习和记忆的损伤作用较为明显。然而,人类暴露环境化学物质最明显的特点是暴露于其混合物中。截至目前,联合暴露于铅、镉、砷和汞这四种重金属对神经系统功能的影响尚未见报道。研究证实,神经元通过突触连接活动的强度和频率的改变来处理和保留信息,神经元的突触重构与神经系统功能如学习和记忆密切相关。突触高度动态重构性的关键在于突触处特定结构树突棘的重排。此外,植物多酚类化合物是广泛存在于植物体内的一种具有多个酚羟基的次生代谢产物,具有抗氧化、抗肿瘤、抗毒性以及神经系统保护等作用。常见的植物多酚类化合物葡萄多酚白藜芦醇和茶多酚表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechin gallate,EGCG)均具有很好的神经保护特性,并对突触重构损伤具有一定的调节改善作用。故本课题旨在探讨铅、镉、砷和汞四种重金属低剂量联合暴露对神经突触重构损伤以及植物多酚类化合物的调节干预作用。本课题首先在体外培养的不同神经细胞上采用正交和析因实验设计探索铅、镉、砷和汞四种重金属在其混合物中的交互作用特点,并筛选出重金属混合物低水平的作用剂量和模式。然后,通过整体动物实验验证低剂量铅、镉、砷和汞联合暴露对仔鼠多系统毒性损伤,尤其是神经系统损伤,并进一步研究其对神经突触重构的影响及其机制。最后,通过给予植物多酚类化合物白藜芦醇和EGCG探讨其对铅、镉、砷和汞四种重金属所致神经突触重构损伤的干预作用。现将本论文主要研究结果归纳如下:1.四金属联合暴露剂量和模式的选择。CCK8检测细胞活力,并结合正交实验设计探索铅、镉、砷和汞四种重金属在其混合物(metal mixtures,MM)中的细胞毒性交互作用的特点。结果发现,当单个重金属暴露浓度低于未观察到有害作用水平(no observed adverse effect levels,NOAELs)时,四金属联合暴露可产生协同作用引起细胞毒性损伤,且当单个重金属剂量与一般人群血液负荷水平比例相似时,其联合作用效果最强。故选择一般人群血液中该四种重金属水平(1×MM)以及其5倍(5×MM)和10倍(10×MM)的水平进行析因实验设计后检测神经细胞活力、凋亡、活性氧以及胞内游离钙水平等细胞损伤指标。结果发现,低剂量四金属联合暴露产生新的不同于两种或三种重金属的联合作用毒性效应。2.四金属联合暴露对整体动物各系统损伤。孕鼠通过饮水暴露浓度梯度铅、镉、砷和汞四金属混合物(对照组、1×MM、5×MM、10×MM和20×MM)直至仔鼠断乳。仔鼠经过胚胎和哺乳等发育敏感期暴露四金属后进行相关实验。ICP-MS检测血液和脑组织铅、镉、砷和汞含量;HE染色检测各脏器病理损伤;ELISA试剂盒检测各脏器生化指标水平。实验结果显示,1×MM暴露组仔鼠血液中铅、镉、砷和汞含量与一般人群四金属暴露浓度接近。此外,仔鼠血液和脑组织中铅、镉、砷、汞含量均随着四金属联合暴露浓度的增加而呈现剂量反应增加。因此本实验四金属联合暴露动物模型建立成功。四金属联合暴露仔鼠包括大脑、肝脏、睾丸和肾脏在内的多个脏器病理损伤和生化分子水平损伤均随着暴露剂量增加而加重,且以神经系统损伤尤为明显。3.四金属联合暴露对神经系统功能及突触重构损伤。通过一系列行为功能试验检测仔鼠学习记忆、感知觉以及运动能力。结果发现,仔鼠学习记忆和感知觉能力损伤随着四金属联合暴露剂量增加而加重。而仔鼠运动能力对四金属联合暴露后不敏感。需要强调的是,悬崖回避试验检测的仔鼠空间感知觉能力在1×MM组,即一般人群四金属暴露水平暴露后便出现差异。在大鼠神经行为功能发现损伤的基础上,进一步在体外培养的海马神经元和神经生长因子(nerve growth factor,NGF)诱导的PC12细胞上使用鬼笔环肽F-actin染色分析细胞形态结构。结果发现,四金属联合暴露降低了原代海马神经元树突的长度和分支以及树突棘的密度和成熟表型,并缩短了NGF诱导的PC12细胞生长的神经突起长度。4.四金属联合暴露对突触重构相关通路Snk-SPAR损伤。细胞免疫荧光检测神经细胞血清诱导激酶(serum-induced kinase,Snk)和树突棘相关的Rap三磷酸鸟苷酶激活蛋白(Spine-associated Rap GTPase-activating protein,SPAR)蛋白表达量;构建干扰质粒sh RNA Snk、野生型质粒Wt-SPAR、突变型质粒Mut-SPAR,并进行细胞质粒转染。结果发现,海马神经元和NGF诱导PC12细胞SPAR表达在四金属联合暴露后出现浓度依赖性地降低。SPAR过表达减缓四金属联合暴露所致NGF诱导PC12细胞神经突起生长的变化,Mut-SPAR转染比Wt-SPAR转染表现出更好地改善效果。进一步研究发现,海马神经元和NGF诱导PC12细胞Snk的表达也随四金属联合暴露浓度增加而上调。Snk激动剂加重四金属所致NGF诱导PC12细胞神经突起和Snk-SPAR通路的变化。Snk低表达改善四金属联合暴露所致的NGF诱导PC12细胞神经突起和Snk-SPAR通路的变化。5.白藜芦醇和EGCG对四金属联合暴露后突触重构损害的干预作用。CCK8检测细胞活力;流式细胞术检测细胞凋亡、活性氧和胞内游离钙水平;鬼笔环肽F-actin染色分析细胞形态结构;细胞免疫荧光检测神经细胞Snk和SPAR蛋白表达量。结果发现,10μM白藜芦醇和10μM EGCG分别处理后,均逆转了四金属联合暴露所致的细胞毒性损伤。此外,四金属联合暴露通过激活Snk-SPAR通路而导致的突触重构损伤在白藜芦醇和EGCG干预后也出现逆转。以上结果表明,在一般人群暴露的相关水平,且单个重金属暴露浓度低于NOAELs时,铅、镉、砷和汞联合暴露可能通过激活Snk-SPAR通路引起突触重构损伤进而导致神经行为障碍。而植物多酚类化合物白藜芦醇和EGCG可以逆转铅、镉、砷和汞联合暴露所致突触重构损伤,它们可以作为预防和治疗重金属联合暴露所致以突触重构损伤为特征的中枢神经系统紊乱相关疾病的潜在干预药物。
【学位单位】：南昌大学
【学位级别】：博士
【学位年份】：2018
【中图分类】：R114
【文章目录】：
摘要
abstract
缩略词表
第1章 引言
    1.1 重金属的神经毒性作用研究进展
        1.1.1 铅的神经毒性作用
        1.1.2 镉的神经毒性作用
        1.1.3 砷的神经毒性作用
        1.1.4 汞的神经毒性作用
    1.2 植物多酚类化合物的神经保护作用研究进展
        1.2.1 白藜芦醇的神经保护作用
        1.2.2 表没食子儿茶素没食子酸酯的神经保护作用
    1.3 本课题的研究目的、意义和主要内容
        1.3.1 课题来源
        1.3.2 本课题立题背景及意义
        1.3.3 主要研究内容
第2章 四金属联合暴露剂量和模式的选择
    2.1 概述
    2.2 材料和方法
        2.2.1 材料
        2.2.2 方法
    2.3 结果
        2.3.1 铅、镉、砷和汞对不同类型神经细胞活力的单独作用
        2.3.2 铅、镉、砷和汞联合暴露交互作用规律探索
2+]i的影响'>        2.3.3 四金属联合暴露对细胞分子水平凋亡、ROS和 [Ca²⁺]i的影响
    2.4 讨论
    2.5 小结
第3章 四金属联合暴露对整体动物各系统损伤
    3.1 概述
    3.2 材料和方法
        3.2.1 材料
        3.2.2 方法
    3.3 结果
        3.3.1 四金属联合暴露对仔鼠基本情况影响
        3.3.2 四金属联合暴露对仔鼠血元素影响
        3.3.3 四金属联合暴露对仔鼠各系统脏器系数影响
        3.3.4 四金属联合暴露对仔鼠各脏器病理影响
        3.3.5 四金属联合暴露对仔鼠各脏器生化及分子水平影响
    3.4 讨论
    3.5 小结
第4章 四金属联合暴露对神经系统功能及突触重构损害
    4.1 概述
    4.2 材料和方法
        4.2.1 材料
        4.2.2 方法
    4.3 结果
        4.3.1 四金属联合暴露对仔鼠行为功能损伤
        4.3.2 四金属联合暴露对原代海马神经元树突结构影响
        4.3.3 四金属联合暴露对NGF诱导PC12细胞突起结构影响
    4.4 讨论
    4.5 小结
第5章 四金属联合暴露对突触重构相关通路SNK-SPAR影响
    5.1 概述
    5.2 材料和方法
        5.2.1 材料
        5.2.2 方法
    5.3 结果
        5.3.1 四金属联合暴露下调海马神经元和NGF诱导PC12细胞SPAR表达
        5.3.2 SPAR过表达减缓四金属导致的NGF诱导PC12细胞神经突起生长的变化
        5.3.3 四金属暴露上调海马神经元和NGF诱导PC12细胞Snk的表达
        5.3.4 Snk激动剂加重四金属导致的NGF诱导PC12细胞神经突起和Snk-SPAR通路的变化
        5.3.5 Snk低表达减缓四金属导致的NGF诱导PC12细胞神经突起和Snk-SPAR通路的变化
    5.4 讨论
    5.5 小结
第6章 植物多酚类化合物对四金属联合暴露后突触重构损害的干预作用
    6.1 概述
    6.2 材料和方法
        6.2.1 材料
        6.2.2 方法
    6.3 结果
        6.3.1 白藜芦醇和EGCG干预作用剂量的选择
2+]i的干预作用'>        6.3.2 白藜芦醇和EGCG对四金属联合暴露后细胞活力、凋亡、ROS和[Ca²⁺]i的干预作用
        6.3.3 白藜芦醇和EGCG对四金属联合暴露后神经突起结构损伤的干预作用
        6.3.4 白藜芦醇和EGCG对四金属联合暴露后Snk-SPAR通路改变的干预作用
    6.4 讨论
    6.5 小结
第7章 结论
    7.1 概述
    7.2 主要结论
    7.3 本课题创新之处
    7.4 进一步的工作方向
致谢
参考文献
攻读学位期间的研究成果

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本文编号：2884706