万古霉素功能化磁珠非靶向分离结合滚环扩增特异性检测金黄色葡萄球菌的研究

发布时间：2021-01-09 02:27

　　食品安全是全球性的热点问题,而食源性致病菌是导致食品安全问题频发的主要原因。目前检测食源性致病菌的金标准仍然以传统培养法为主,该方法耗时较长且操作繁复,影响结果判别的时效性,也与食源性致病菌的快速识别检测理念相悖,因此建立快速灵敏的致病菌检测技术具有重要意义。抗生素磁分离（Antibiotic magnetic separation,AMS）是一种简单快速的致病菌富集前处理手段,是将抗生素作为识别分子直接或间接的修饰在磁性粒子表面从而非靶向捕获细菌,并在外部磁场作用下富集分离,省去了细菌预增菌培养所需要的时间。此外,抗生素磁分离较免疫磁分离相比成本更低,性质更稳定,因而其在食源性致病菌检测中具有较好的应用前景。本研究选用万古霉素（Vancomycin,Van）修饰的纳米磁珠（Magnetic nanobeads,MBs）作为食源性致病菌分离富集前处理手段,结合滚环扩增（Rolling circle amplification,RCA）制备的DNA纳米花（DNA flowers,DNFs）或RCA单链产物,在不需要提取目的菌DNA模板的情况下,负载酶或荧光染料,实现对金黄色葡萄球菌（St... 

【文章来源】：南昌大学江西省 211工程院校

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【部分图文】：

图２．２?Ｖａｎ－ＭＢｓ捕获５１．?的表征??

及ＲＣＡ反应体系＿在之前的研究??中己经进行过优化，所以本研宄所建立的Ｖａ?ｎ?－?Ｍ?Ｂ?ｓ结合普通比色法检测Ｓ??ｆｌｗｒｅｗ，对ｂｉｏｔｉｎ－ｌｇＧ浓度、ＳＡ－ＨＲＰ用量进行了优化，以期获得最佳检测结??果。??２．４．３．１?Ｂｉｏｔｉｎ－ＩｇＧ?浓度的优化??在检测中，Ｂｉｏｔｉｎ－ＩｇＧ用量过少，会导致多数细菌无法与Ｂｉｏｔｉｎ－ＩｇＧ结合，??造成较大的实验误差，而Ｂｉｏｔｉｎ－ＩｇＧ过多又会造成一定程度的试剂浪费，因??此对于Ｂｉｏｔｉｎ－ＩｇＧ的用量进行了优化。如图２．４所示，当Ｂｉｏｔｉｎ－ＩｇＧ的浓度为??５?ｎＭ时能得到最高的ＡＯＤ。因此，后续实验选用Ｂｉｏｔｉｎ－ＩｇＧ的浓度为５?ｎＭ??为最佳浓度。??０．２５－１???０．２０－??１０．１５－??０．０５－??０．００?Ｊ?．???．?１???０?３?６?９?１２?１５??Ｔｈｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｂｉｏｔｉｎ－ＩｇＧ?（ｎＭ）??图２．３?Ｂｉｏｔｉｎ－ＩｇＧ浓度的优化??Ｆｉｇｕｒｅ?２．３?Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?Ｂｉｏｔｉｎ－ＩｇＧ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ??２．４．３＿２?ＳＡ－ＨＲＰ浓度的优化??本研究对ＳＡ－ＨＲＰ的用量也进行了优化。如图２．４所示，随着ＳＡ－ＨＲＰ??的浓度从４０?ｎｇ／ｍＬ增加到１２０?ｐｇ／ｍＬ，?ＡＯＤ也随之增加，随后随着浓度的增??加略微下降。因此，后续实验选用ＳＡ－ＨＲＰ的浓度为１２０?ｐｇ／ｍＬ为最佳浓度。??２６??

?第２章Ｖａｎ－ＭＢｓ－ＤＮＦｓ信号放大比色技术检测金黄色葡萄球菌的研究???０．２５????§?０．Ｈ３．?／??０．０５?＿?Ｙ??０．００??？?ｉ?．???０?６０?１２０?１８０?２４０??Ｔｈｅ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＡ－ＨＲＰ?（ｐｇ／ｍＬ）??图２．４ＳＡ－ＨＲＰ浓度的优化??Ｆｉｇｕｒｅ?２．４?Ｏｐｔｉｍｉｚａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＳＡ－ＨＲＰ?ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ??２．４．４纯菌液中Ｖａｎ－ＭＢｓ结合普通比色法灵敏度的确定??结合上述实验中的最优参数，本研宄对Ｖａｎ－ＭＢｓ结合普通比色法在纯菌??液中的检测范围和ＬＯＤ值进行了确定。如图２．５所示，随着义ａｗｒｅｗ浓度的??逐渐增加ＯＤ值也随之增大，该研究判断阳性的依据是：阴性样本的平均ＯＤ??值＋３ｃｒ值（〇为标准偏差），因此，当待测菌浓度的０Ｄ值高于空白值的平均??ＯＤ值＋３〇值时，即为检测结果为阳性。因此，该方法在ＰＢＳ中的ＬＯＤ值为??３＿３ｘｌ〇５?ＣＦＵ／ｍＬ。??０．５－１???｜?〇－３－?＇／：ｉ｜??Ｃｏｎｔｒｏｌ?４?５?６?７?８??Ｃｏｏｃｅｎｔｉ?ａｔｉｏｎ?ｏｉＳ．?ａｕｒｅｕｓ?（３．３?Ｘ?ｌｇ?ＣＦＵ／ｎｉＬ）??图２．５?Ｖａｎ－ＭＢｓ结合普通比色法ＰＢＳ缓冲液中ＬＯＤ值的确定??Ｆｉｇｕｒｅ?２．５?Ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ?ｏｆ?ＬＯＤ?ｂｙ?Ｖａｎ－ＭＢｓ?ｃｏｍｂｉｎｅｄ?ｗｉｔｈ?ｃｏｍｍｏｎ?ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ?ｉｎ?ＰＢＳ??ｂｕｆｆｅｒ??２７??


本文编号：2965790