环介导等温扩增技术对外源转基因成分检测及其协同验证

发布时间：2017-04-18 17:05

  本文关键词：环介导等温扩增技术对外源转基因成分检测及其协同验证，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：近些年来转基因食品的安全性问题受到了社会各界的广泛关注,因此国家对转基因食品安全的监管力度也在逐步加强。目前对转基因食品的检测,除了常规的单靶标核酸检测外,还包括对多靶标目的基因进行筛选检测和分析。随着技术的不断发展和进步,转基因食品的检测技术也正向着快速、精确、高通量的检测方向发展。常规的转基因食品检测方法主要是聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)技术、实时荧光定量技术,但这些转基因检测技术都需要精密复杂的温度循环仪器而且检测时间比较长,这样就极大限制了它们在现场或者田间快速检测的推广和应用。但近些年等温核酸扩增技术得到了快速的发展,其中环介导等温扩增技术(Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP)凭着特异性和灵敏度高、简单高效、所需仪器简单等的优势在细菌、病毒、转基因食品等领域得到了广泛的应用。本研究选择了转基因粮油原料中常见的3种外源转基因成分,利用环介导等温扩增方法对其外源转基因成分进行检测。根据这3种常见外源转基因成分((CP4 epsps, Pat, NPTⅡ)的基因序列,设计特异性的环介导等温扩增(LAMP)引物,优化反应体系,并通过在扩增产物中加入SYBR Green Ⅰ (1000×)荧光染料,建立了可视化的环介导等温扩增检测方法。实验结果表明,本研究建立的环介导等温扩增方法对这3.种外源转基因成分(CP4 epsps, Pat, NPT Ⅱ)检测的特异性高,灵敏度强,检测限基本上都能达到5-10拷贝,比传统PCR的检测限高,而且整个LAMP检测过程仅需1小时左右,检测结果可以通过琼脂糖凝胶电泳和染料两种方法来判断。为了验证建立的环介导等温扩增方法的实用性和有效性,我们邀请了国内外10家研究机构进行协同验证。对建立的LAMP检测方法验证之后,将该方法运用于样品的实际检测当中。因此,环介导等温扩增技术的运用不仅实现了快速、高效的实验室内部检测,而且也为现场或田间检测提供了强有力的技术支持。
【关键词】：环介导等温扩增 转基因检测 外源转基因成分 协同验证
【学位授予单位】：扬州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R440;R155.5
【目录】：

• 摘要2-3
• Abstract3-8
• 第一章 绪论8-32
• 1 全球转基因植物商业化种植、应用现状8-13
• 1.1 全球转基因种植的概况8-9
• 1.2 转基因食品的概况9-10
• 1.3 转基因食品安全性问题10-11
• 1.4 转基因食品的安全性评价11-13
• 2 国内外转基因食品检测方法研究现状13-18
• 2.1 以蛋白质为基础的检测方法13-14
• 2.2 以核酸为基础的检测方法14-17
• 2.3 新型转基因检测方法17-18
• 2.4 转基因食品检测技术的展望18
• 3 转基因食品中转基因成分检测方法18-20
• 3.1 通用元件的筛选检测19
• 3.2 外源特异性基因检测19
• 3.3 构建特异性检测19
• 3.4 品系特异性检测19-20
• 4 环介导等温扩增技术20-28
• 4.1 环介导等温扩增技术概述20
• 4.2 环介导等温扩增方法的特点20-21
• 4.3 环介导等温扩增方法的引物设计21-22
• 4.4 环介导等温扩增方法的扩增原理22-24
• 4.5 环介导等温扩增方法的操作过程24-25
• 4.6 环介导等温扩增产物的检测方法25-26
• 4.7 环介导等温扩增方法的应用26-28
• 4.8 LAMP方法存在的问题和改进28
• 5 本论文的研究内容和意义28-32
• 5.1 研究背景及意义28-29
• 5.2 主要研究内容29-30
• 5.3 本题目的创新之处和可预期的创造性成果30-32
• 第二章 环介导等温扩增(LAMP)方法对粮油原料外源转基因成分检测方法的建立32-53
• 1 材料与方法32-41
• 1.1 实验材料、仪器与试剂32-33
• 1.2 实验方法33-41
• 2 结果与分析41-49
• 2.1 LAMP检测引物筛选结果41-42
• 2.2 LAMP体系优化的结果42-45
• 2.3 LAMP方法特异性检测结果45-46
• 2.4 LAMP方法灵敏度检测结果46-49
• 3 讨论49-52
• 3.1 植物基因组DNA的提取和质量检测49-50
• 3.2 LAMP检测中引物的设计及筛选50-51
• 3.3 LAMP体系中不同因素的影响51
• 3.4 LAMP体系特异性、灵敏度评价51
• 3.5 LAMP方法的不足之处及解决措施51-52
• 4 本章小结52-53
• 第三章 环介导等温扩增(LAMP)检测方法的国际协同验证53-62
• 1 材料与方法53-57
• 1.1 实验材料、仪器与试剂53-54
• 1.2 实验方法54-57
• 2 结果与分析57-60
• 2.1 LAMP方法协同验证结果反馈57-58
• 2.2 LAMP方法的特异性验证结果58-59
• 2.3 LAMP方法的灵敏度验证结果59-60
• 3 讨论60
• 3.1 国际协同验证特异性结果分析60
• 3.2 国际协同验证灵敏度结果分析60
• 4 本章小结60-62
• 第四章 环介导等温扩增(LAMP)方法在实际检测中的应用62-69
• 1 材料与方法62-64
• 1.1 实验材料、仪器与试剂62-63
• 1.2 实验方法63-64
• 2 结果与分析64-67
• 2.1 优化的LAMP体系对标准物质检测的结果64
• 2.2 LAMP体系对上海出入境盲样进行检测64-65
• 2.3 PCR方法对盲样检测结果的验证65-67
• 3 讨论67-68
• 3.1 LAMP方法在实际样品检测中的优势67
• 3.2 LAMP方法在转基因检测中应用前景67-68
• 4 本章小结68-69
• 参考文献69-76
• 致谢76-78
• 攻读硕士学位期间完成的论文78-79

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本文编号：315324