宁波市八种常见重金属污染物联合毒性研究
发布时间：2017-04-23 16:10
本文关键词：宁波市八种常见重金属污染物联合毒性研究，由笔耕文化传播整理发布。
【摘要】：目的：采用小鼠上皮细胞株（JB6细胞），通过体外实验探索八种常见重金属混合污染物对细胞产生的毒性作用及机制，同时选用抗氧化剂茶多酚（-Epigallocatechin gallate，EGCG）探讨其对多种重金属体外联合毒性是否具有拮抗作用，为多种重金属的联合毒性的研究和防治提供科学依据。 方法：检索相关文献，配置与宁波养殖水体中八种常见重金属污染物的混合浓度比例相似的毒物；由MTT试验检测不同浓度的重金属混合污染物对细胞生存率的影响，并确定后续试验的浓度；通过流式细胞仪检测染毒后细胞的周期和凋亡情况；荧光染料处理染毒后的JB6细胞，借助激光共聚焦显微镜观察其氧化应激产生情况；荧光素酶试验检测细胞中转录因子AP-1和NF-kB的表达情况；运用蛋白免疫印迹法检测细胞中蛋白的表达情况；在重金属混合污染物暴露细胞的基础上加或者不加10μM抗氧化剂EGCG，检测抗氧化剂组与未加抗氧化剂组细胞毒性、细胞周期、细胞内氧化应激的情况、Nrf2和HO-1蛋白的表达情况。 结果：不同浓度的重金属混合污染物染毒细胞24h后，随染毒浓度的增加细胞毒性增大，处理组2-9与对照组相比差异均有统计学意义；流式细胞仪检测发现，细胞周期出现S期阻滞，细胞凋亡率增加；在H2DCFDA、DHA和Hoechst共同染色下经共聚焦显微镜发现细胞内ROS产生量增多，并且随浓度增高，ROS逐渐增多；不同浓度的重金属混合污染物暴露细胞12h后，经荧光素酶检测发现能够上调JB6细胞中转录因子AP-1和NF-kB的表达水平。染毒24h后提取细胞蛋白，经蛋白免疫印迹实验检测发现C-jun蛋白和p65蛋白表达量随浓度的增大而逐渐升高。 加入10μM抗氧化剂EGCG后，与未加抗氧化剂组相比，抗氧化剂组的细胞毒性得到一定抑制，细胞内ROS的产生量减少，S期的阻滞作用有所下降，蛋白检测发现Nrf2和HO-1蛋白的表达减弱，这些结果证实了EGCG对重金属混合污染物的毒性有一定的拮抗作用。 结论：重金属混合物可以阻滞细胞周期，诱导细胞凋亡，诱导细胞发生氧化应激，增加ROS的产生量，使JB6细胞转录因子AP-1和NF-kB表达水平增加，蛋白免疫印迹试验检测C-jun和p65蛋白的表达增加，由此可能促使细胞发生癌变。EGCG可以对重金属混合物引起的细胞毒性起到一定保护作用，，减轻细胞周期的阻滞，对细胞内ROS的产生起到一定的拮抗作用，并能下调Nrf2和HO-1蛋白的表达。
【关键词】：重金属混合污染物 JB6细胞 毒性 EGCG 氧化应激
【学位授予单位】：宁波大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：
- 摘要4-6
- Abstract6-9
- 引言9-14
- 1 研究内容14-15
- 1.1 重金属混合污染物对 JB6 细胞的毒性作用14
- 1.2 抗氧化剂 EGCG 对重金属混合污染物毒性的预防和拮抗作用14-15
- 2 实验材料和方法15-28
- 2.1 实验材料15-17
- 2.1.1 八种常见重金属15
- 2.1.2 实验用细胞株15
- 2.1.3 实验用主要仪器15-16
- 2.1.4 主要试剂16-17
- 2.2 实验方法17-21
- 2.2.1 细胞培养及处理用液17-18
- 2.2.2 EGCG 的配置18
- 2.2.3 MTT 试验用试剂18-19
- 2.2.4 蛋白免疫印迹实验相关试剂及配置19-21
- 2.3 研究方法21-28
- 2.3.1 八种常见重金属混合污染物的比例的选定及合理配置21-22
- 2.3.2 细胞培养及处理22-23
- 2.3.3 MTT 实验23-24
- 2.3.4 细胞周期实验24
- 2.3.5 细胞凋亡实验24
- 2.3.6 细胞自由基（ROS）生成状况观察实验24-25
- 2.3.7 荧光素酶检测基因（Luciferase 法）表达实验25
- 2.3.8 蛋白免疫印迹（West-bloting 法）实验25-27
- 2.3.9 数据的处理27-28
- 3 实验结果28-39
- 3.1 八种常见重金属混合污染物对 JB6 细胞毒性的影响28-35
- 3.1.1 重金属混合物对 JB6 细胞生存率的影响28
- 3.1.2 重金属混合物对 JB6 细胞形态的影响28-29
- 3.1.3 重金属混合物对 JB6 细胞周期及细胞凋亡的影响29-32
- 3.1.4 重金属混合物对 JB6 细胞自由基产生的影响32-33
- 3.1.5 重金属混合物对细胞荧光素酶表达情况的影响33-34
- 3.1.6 重金属混合物对细胞相关信号蛋白表达的影响34-35
- 3.2 抗氧化剂茶多酚对重金属混合物产生的细胞毒性的拮抗与抑制作用35-39
- 3.2.1 抗氧化剂茶多酚对重金属混合物细胞生存率的影响35-36
- 3.2.2 抗氧化剂茶多酚对重金属混合物引起的细胞周期的影响36-37
- 3.2.3 抗氧化剂茶多酚对重金属混合物引起的细胞氧化应激损伤的影响37-39
- 3.2.4 抗氧化剂茶多酚对重金属混合物引起的细胞通路蛋白表达的影响39
- 4 讨论39-43
- 4.1 重金属混合物对 JB6 细胞生存率的影响40
- 4.2 重金属混合物对细胞的形态学影响40
- 4.3 重金属混合物对细胞周期及凋亡的影响40-41
- 4.4 细胞氧化应激情况41
- 4.5 细胞内转录因子 AP-1 和 NF-kB 的表达情况41-42
- 4.6 细胞内相关信号蛋白表达的情况42
- 4.7 EGCG 对重金属混合污染物产生的细胞毒性的拮抗作用42-43
- 5 全文小结43-45
- 参考文献45-52
- 附录A 缩略词52-54
- 附录B 综述54-67
- 参考文献62-67
- 在学研究成果67-69
- 致谢69
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