基于免疫磁珠—PCR的单增李斯特菌检测方法的建立及p60单链抗体的制备
发布时间：2021-08-27 10:15
单核细胞增生性李斯特菌简称单增李斯特菌,是一种常见的食源性致病菌,具有污染范围广、环境耐受性强、致死率高等特点。人们摄食被单增李斯特菌污染的食物后,可引起脑膜炎、败血症、脓肿及孕妇流产等一系列疾病。近年来,世界各国多次爆发单增李斯特菌的感染事件,造成了巨大的财产损失和人员伤亡,引起人们的高度重视。因此,建立食品中单增李斯特菌快速、准确、可靠的检测方法具有十分重要的意义。传统的单增李斯特菌分离鉴定方法具有费时耗力等缺点,不能满足快速检测的需要,而免疫学方法与分子生物学方法以其检测时间短、准确率高等优点被广泛应用到致病菌快速检测领域,并取得了良好的效果。本研究将免疫磁珠与双重PCR联用建立了单增李斯特菌的快速检测的方法。此外,本研究还制备了单增李斯特菌膜蛋白p60对应的单链抗体。主要研究结果如下:（1）PCR扩增单增李斯特菌iap基因,将其插入pET-28a（+）质粒中,转化E.coli BL21（DE3）成功构建p60蛋白表达菌株,经IPTG诱导表达获得单增李斯特菌p60蛋白,并经镍柱纯化后获得纯化的p60蛋白。（2）以p60蛋白为免疫原免疫新西兰大白兔,四次免疫后收集血清,经Prote...
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
胶体金免疫层析试纸条的构造Fig.1-1Theconstructionofcolloidalgoldimmunochromatographicstrip
33图 3-1 iap 基因琼脂糖凝胶电泳图M：DNA 标准；泳道 1，2：iap 基因序列扩增。Fig. 3-1Agarose gel electrophoresis of iap geneM: DNAMarker, Lane 1, 2: iap gene.0 蛋白表达菌的构建重组质粒载体转化入 E. coli BL21（DE3），单菌落以 iap 基因扩增引物进行菌落 PCR 扩 3-2 所示，结果表明所挑选的 6 个单菌落均被来的诱导表达实验。
图 3-2 转化后菌落 PCR 验证Fig. 3-2 PCR verification of bacterial colonies after transformation白的诱导表达及可溶性分析成功的菌株进行扩大培养，加入 0.1M 的 IPTG，并于 25℃，200rpm p60 蛋白表达，结果经 SDS-PAGE 分析表明在 65KDa 左右有目的条一致，说明目的蛋白表达成功。而且在破碎菌体的沉淀以及上清中均知重组蛋白是部分可溶性表达。根据 Bubert 等人的研究（Bubert et al白末端易降解，所以推测纯化产物出现两条带的情况是由于末端降解
【参考文献】：
期刊论文
[1]单增李斯特菌内化素A单克隆抗体制备及胶体金免疫层析试纸条的研制[J]. 刘美辰,张彦明,韩金媛,刘小熙,郭健. 粮食科技与经济. 2016(06)
[2]2007年-2009年山东省生肉中单增李斯特菌的耐药性及分子分型分析[J]. 陈玉贞,侯配斌,贾静,张华宁,关冰,毕振旺. 中国卫生检验杂志. 2012(02)
[3]免疫层析试纸条技术及其在食源性致病菌检测中应用的研究进展[J]. 李怀明,许恒毅,熊勇华. 食品科学. 2011(17)
[4]单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J]. 孔君,刘箐,韩跃武,王天昌,刘金芝. 免疫学杂志. 2011(02)
[5]IMS-PCR对食品中单增李斯特菌快速检测[J]. 李敏,孟瑾,郑小平,陈美莲,韩奕奕,顾鸣,沈鹤柏,支援. 乳业科学与技术. 2010(03)
[6]李斯特菌的特异性抗体及其应用研究进展[J]. 何勇琴,潘迎捷,卢瑛. 中国卫生检验杂志. 2009(12)
[7]单核细胞增生李斯特菌PrfA蛋白转录调控毒力基因表达的分子机制[J]. 罗勤,张晓莉,李兵,冯爱平,钱跃. 微生物学通报. 2008(02)
[8]抗李斯特菌特异单抗试剂的研制及应用[J]. 范红结,焦新安,刘秀梵,张如宽. 江苏农学院学报. 1997(01)
[9]由产单核细胞李氏杆菌引起母牛流产和犊牛腹泻的诊断报告[J]. 滕振文,沈正达,孙让林,李平,丁福会,尚军茂,王国防. 中国畜禽传染病. 1989(Z1)
[10]李斯特菌败血症六例报告[J]. 吴莉,张贤华,陈豪,印学蕾. 中华儿科杂志. 2008 (01)
硕士论文
[1]单核细胞增生李斯特菌毒力相关基因的筛选鉴定及其功能研究[D]. 蔡雪薛.扬州大学 2017
[2]甲基对硫磷特异性单克隆抗体和单链抗体的制备及应用[D]. 王慧敏.山东农业大学 2017
[3]三种分型技术对食源性单增李斯特菌分型研究[D]. 赵一鸣.华南理工大学 2015
[4]免疫磁珠—实时荧光PCR联用技术快速检测食品中单增李斯特菌的研究[D]. 刘燕艳.浙江大学 2014
[5]单增李斯特菌特异性的膜表面蛋白的抗体的制备[D]. 李志清.暨南大学 2012
本文编号：3366160
【文章来源】：山东农业大学山东省
【文章页数】：64 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
胶体金免疫层析试纸条的构造Fig.1-1Theconstructionofcolloidalgoldimmunochromatographicstrip
33图 3-1 iap 基因琼脂糖凝胶电泳图M：DNA 标准；泳道 1，2：iap 基因序列扩增。Fig. 3-1Agarose gel electrophoresis of iap geneM: DNAMarker, Lane 1, 2: iap gene.0 蛋白表达菌的构建重组质粒载体转化入 E. coli BL21（DE3），单菌落以 iap 基因扩增引物进行菌落 PCR 扩 3-2 所示，结果表明所挑选的 6 个单菌落均被来的诱导表达实验。
图 3-2 转化后菌落 PCR 验证Fig. 3-2 PCR verification of bacterial colonies after transformation白的诱导表达及可溶性分析成功的菌株进行扩大培养，加入 0.1M 的 IPTG，并于 25℃，200rpm p60 蛋白表达，结果经 SDS-PAGE 分析表明在 65KDa 左右有目的条一致，说明目的蛋白表达成功。而且在破碎菌体的沉淀以及上清中均知重组蛋白是部分可溶性表达。根据 Bubert 等人的研究（Bubert et al白末端易降解，所以推测纯化产物出现两条带的情况是由于末端降解
【参考文献】：
期刊论文
[1]单增李斯特菌内化素A单克隆抗体制备及胶体金免疫层析试纸条的研制[J]. 刘美辰,张彦明,韩金媛,刘小熙,郭健. 粮食科技与经济. 2016(06)
[2]2007年-2009年山东省生肉中单增李斯特菌的耐药性及分子分型分析[J]. 陈玉贞,侯配斌,贾静,张华宁,关冰,毕振旺. 中国卫生检验杂志. 2012(02)
[3]免疫层析试纸条技术及其在食源性致病菌检测中应用的研究进展[J]. 李怀明,许恒毅,熊勇华. 食品科学. 2011(17)
[4]单克隆抗体制备技术的最新进展及应用前景[J]. 孔君,刘箐,韩跃武,王天昌,刘金芝. 免疫学杂志. 2011(02)
[5]IMS-PCR对食品中单增李斯特菌快速检测[J]. 李敏,孟瑾,郑小平,陈美莲,韩奕奕,顾鸣,沈鹤柏,支援. 乳业科学与技术. 2010(03)
[6]李斯特菌的特异性抗体及其应用研究进展[J]. 何勇琴,潘迎捷,卢瑛. 中国卫生检验杂志. 2009(12)
[7]单核细胞增生李斯特菌PrfA蛋白转录调控毒力基因表达的分子机制[J]. 罗勤,张晓莉,李兵,冯爱平,钱跃. 微生物学通报. 2008(02)
[8]抗李斯特菌特异单抗试剂的研制及应用[J]. 范红结,焦新安,刘秀梵,张如宽. 江苏农学院学报. 1997(01)
[9]由产单核细胞李氏杆菌引起母牛流产和犊牛腹泻的诊断报告[J]. 滕振文,沈正达,孙让林,李平,丁福会,尚军茂,王国防. 中国畜禽传染病. 1989(Z1)
[10]李斯特菌败血症六例报告[J]. 吴莉,张贤华,陈豪,印学蕾. 中华儿科杂志. 2008 (01)
硕士论文
[1]单核细胞增生李斯特菌毒力相关基因的筛选鉴定及其功能研究[D]. 蔡雪薛.扬州大学 2017
[2]甲基对硫磷特异性单克隆抗体和单链抗体的制备及应用[D]. 王慧敏.山东农业大学 2017
[3]三种分型技术对食源性单增李斯特菌分型研究[D]. 赵一鸣.华南理工大学 2015
[4]免疫磁珠—实时荧光PCR联用技术快速检测食品中单增李斯特菌的研究[D]. 刘燕艳.浙江大学 2014
[5]单增李斯特菌特异性的膜表面蛋白的抗体的制备[D]. 李志清.暨南大学 2012
本文编号：3366160
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