circHECTD1/HECTD1参与SiO 2 诱导肺内皮间质转化的机制研究
发布时间：2021-10-29 05:31
目的:矽肺是吸入大量游离二氧化硅（SiO2）引起,以肺部炎症和晚期纤维化为主的疾病。暴露于SiO2的成纤维细胞被激活后,不断增加和转型为肌成纤维细胞,分泌大量细胞外基质（ECM）。随着肌成纤维细胞数目的不断增加,肺部的成纤维灶逐渐形成,并且逐渐取代正常的肺细胞组织,引起肺部结构的异常重塑,进而触发肺纤维化。尽管肌成纤维细胞的增殖转型是成纤维细胞灶的主要来源,但近年的研究表明,在肺纤维化过程中部分成纤维细胞灶的细胞可能由其它肺部细胞转化而来,其中肺泡上皮细胞和血管内皮细胞分别通过上皮-间质转化（EMT）和内皮-间质转化（EndMT）形成间质细胞（成纤维细胞、肌成纤维细胞）,被认为是纤维化过程中局部成纤维细胞的重要来源之一,但详细作用机制尚不清楚。EndMT被认为是EMT的一种特殊形式,在上皮和内皮细胞获得间质特性过程中发挥重要作用,是诱导肺纤维化发生的一种重要来源。本课题将着重研究circHECTD1/HECTD1参与SiO2诱导EndMT的过程和机制。方法:利用C57BL及STK TEK-GFP 287 Sato/JNj...
【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
小鼠矽肺模型中发生EndMT图A：SiriusRed代表天狼猩红染色，Tie2-GFP代表内皮细胞的标志物，小鼠矽肺模型
结果整体水平证实 EndMT 现象后，离体水平建立 SiO2暴露模型，并将研究移到 MML1 细胞上。首先每孔接种 1 ml 的密度为 1×105/ml 的 MML1 细 孔板内，24 h 更换新鲜培养基后每孔分别加入 20 μl 的 SiO2（50 mg/ml）理 0 h、6 h、12 h、24 h、48 h，收取蛋白样品于-80℃保存，WB 实验检中相关标志物的变化。如图 3.A-D，WB 实验结果显示，SiO2刺激细胞后志物 COL1A1、COL3A1、Acta 2 的表达量随处理时间延长呈时间依赖性增皮细胞标志物 Cdh 5、PECAM 1 的表达量呈时间依赖性降低，提示 SiO2ML1 细胞获得间质特性。细胞免疫组化对上述 WB 结果进行辅助证明， 结果显示，SiO2模型组与 PBS 组相比，内皮细胞的标志物 PECAM 1 表低，间质的标志物 Acta 2 的表达量增加，且 PECAM 1 与 Acta 2 出现共定，更进一步证实了 SiO2在体外诱导 EndMT 的发生。
4.3 HECTD1 参与 SiO2诱导的 EndMT前期我们在探究 EndMT 时，发现一种去泛素化酶 MCPIP1 在其中发挥着重要作用，这提示泛素化相关蛋白可能参与间质转化的发生。一方面 HECTD1 作为一种 E3 泛素连接酶与 MCPIP1 功能具有相关性；另一方面 HECTD1 不仅决定靶蛋白特异性，在泛素-蛋白酶体系统中也发挥着重要作用，参与细胞动态的调节。因此，本课题选定 HECTD1 为目标蛋白，探究 SiO2诱导 EndMT 发生的具体分子机制。首先探究 SiO2是否影响 HECTD1 的表达，如图 5.A-B，WB 结果表明，MML1 细胞 SiO2暴露模型下 HECTD1 的表达受抑制且抑制效应随 SiO2处理时间的延长呈时间依赖性增加，并在 48 h 时抑制达到最显著效果，提示 SiO2刺激内皮细胞后 HECTD1 的表达受抑制。为了探究 HECTD1 的表达变化是否与EndMT 的发生相关，利用 CRISPER/Cas9 技术过表达 HECTD1，图 5.C-D 为 WB实验观察到过表达 HECTD1 成功的结果。
本文编号：3464059
【文章来源】：东南大学江苏省 211工程院校 985工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：70 页
【学位级别】：硕士
【部分图文】：
小鼠矽肺模型中发生EndMT图A：SiriusRed代表天狼猩红染色，Tie2-GFP代表内皮细胞的标志物，小鼠矽肺模型
结果整体水平证实 EndMT 现象后，离体水平建立 SiO2暴露模型，并将研究移到 MML1 细胞上。首先每孔接种 1 ml 的密度为 1×105/ml 的 MML1 细 孔板内，24 h 更换新鲜培养基后每孔分别加入 20 μl 的 SiO2（50 mg/ml）理 0 h、6 h、12 h、24 h、48 h，收取蛋白样品于-80℃保存，WB 实验检中相关标志物的变化。如图 3.A-D，WB 实验结果显示，SiO2刺激细胞后志物 COL1A1、COL3A1、Acta 2 的表达量随处理时间延长呈时间依赖性增皮细胞标志物 Cdh 5、PECAM 1 的表达量呈时间依赖性降低，提示 SiO2ML1 细胞获得间质特性。细胞免疫组化对上述 WB 结果进行辅助证明， 结果显示，SiO2模型组与 PBS 组相比，内皮细胞的标志物 PECAM 1 表低，间质的标志物 Acta 2 的表达量增加，且 PECAM 1 与 Acta 2 出现共定，更进一步证实了 SiO2在体外诱导 EndMT 的发生。
4.3 HECTD1 参与 SiO2诱导的 EndMT前期我们在探究 EndMT 时，发现一种去泛素化酶 MCPIP1 在其中发挥着重要作用，这提示泛素化相关蛋白可能参与间质转化的发生。一方面 HECTD1 作为一种 E3 泛素连接酶与 MCPIP1 功能具有相关性；另一方面 HECTD1 不仅决定靶蛋白特异性，在泛素-蛋白酶体系统中也发挥着重要作用，参与细胞动态的调节。因此，本课题选定 HECTD1 为目标蛋白，探究 SiO2诱导 EndMT 发生的具体分子机制。首先探究 SiO2是否影响 HECTD1 的表达，如图 5.A-B，WB 结果表明，MML1 细胞 SiO2暴露模型下 HECTD1 的表达受抑制且抑制效应随 SiO2处理时间的延长呈时间依赖性增加，并在 48 h 时抑制达到最显著效果，提示 SiO2刺激内皮细胞后 HECTD1 的表达受抑制。为了探究 HECTD1 的表达变化是否与EndMT 的发生相关，利用 CRISPER/Cas9 技术过表达 HECTD1，图 5.C-D 为 WB实验观察到过表达 HECTD1 成功的结果。
本文编号：3464059
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yufangyixuelunwen/3464059.html
