不同来源Lfcin的抗肿瘤、抗炎症及免疫调节作用的对比研究

发布时间：2017-05-10 11:00

  本文关键词：不同来源Lfcin的抗肿瘤、抗炎症及免疫调节作用的对比研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：牛乳铁蛋白素(Bovine Lactoferricin,Lfcin B)是牛乳中乳铁蛋白在胃蛋白酶酸性环境水解产生的一种活性多肽,人乳铁蛋白素(Human Lactoferricin,Lfcin H)是人乳中乳铁蛋白水解产生的一种活性多肽,国内外主要研究Lfcin B的生物活性,对Lfcin H研究较少,本课题用不同质量浓度的Lfcin B和Lfcin H分别对白血病细胞Jurkat、小鼠巨噬细胞、小鼠脾淋巴细胞作用,探讨Lfcin B和LfcinH的抗肿瘤、抗炎症及免疫调节作用并比较两者的差异性和相关性,为将Lfcin开发成生物型抗肿瘤药物、婴儿配方奶粉和乳产品提供理论和实验依据。本研究采用MTT法检测Lfcin B和Lfcin H对Jurkat细胞增殖影响;Hoechst33258染色法荧光显微镜观察Jurkat细胞核的变化;运用Annexin V-FITC/PI双标记流式细胞术将Lfcin B和Lfcin H促进Jurkat细胞凋亡的阶段进行区分;JC-1染色激光共聚焦显微镜观察细胞线粒体膜电位的改变;采用Griess法测定Lfcin B和Lfcin H对LPS刺激后的小鼠巨噬细胞释放NO的含量;CCK-8法检测Lfcin B和Lfcin H单独作用对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响及与丝裂原共同作用对小鼠T、B淋巴细胞增殖作用的影响;ELISA法测定巨噬细胞释放TNF-α的含量和淋巴细胞释放IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的含量。实验研究结果如下:(1)MTT结果显示Lfcin H和Lfcin B对Jurkat细胞有显著的抑制作用(P0.05),呈剂量依赖性;经Lfcin B和Lfcin H处理后的Jurkat细胞在荧光显微镜下均可见细胞核皱缩、碎裂呈凋亡特征;激光共聚焦显微镜观察到Jurkat细胞线粒体膜电位下降;流式细胞术检测发现Jurkat细胞经Lfcin B和Lfcin H处理48 h时主要发生早期凋亡。研究结果表明100~300μg/mL的Lfcin B和Lfcin H可显著抑制Jurkat细胞增殖并诱导细胞凋亡,150μg/m L的Lfcin H和250μg/m L的Lfcin B为抑制Jurkat细胞增殖的最佳作用浓度,推断Jurkat细胞凋亡的机制可能是通过影响线粒体膜电位导致Jurkat细胞凋亡并抑制细胞增殖。(2)Griess法和CCK-8结果显示,Lfcin B和Lfcin H能显著抑制LPS刺激后的Balb/c小鼠巨噬细胞释放NO和TNF-α,呈剂量依赖性,与空白组相比具有显著差异(P0.05)但均低于LPS对照组(1μg/mL的LPS)。100μg/m L的Lfcin H和150μg/m L的LfcinB为抑制巨噬细胞释放NO和TNF-α的最佳作用浓度,LPS活化后可以诱导巨噬细胞产生NO和促炎症细胞因子TNF-α,推测Lfcin B和Lfcin H可能是通过抑制NO的释放和促炎症细胞因子TNF-α的分泌,避免机体组织受到损伤,达到了抗炎的目的。(3)CCK-8结果显示,Lfcin B和Lfcin H能有效的促进脾淋巴细胞的增殖,并与Con A、LPS对T、B淋巴细胞的增殖有协同刺激作用,并且能显著促进小鼠脾淋巴细胞体外分泌细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α,与对照组相比具有显著差异(P0.05),研究结果表明Lfcin B和Lfcin H质量浓度分别在为150μg/mL、100μg/m L与48 h时脾淋巴细胞的增殖效果最佳,四种细胞因子的分泌量均达到最大,推测Lfcin B和Lfcin H可能是通过促进脾淋巴细胞增殖和诱导其分泌细胞因子,从而增强机体的免疫调节功能。综上所述,本研究可以得出以下结论:Lfcin B和Lfcin H能够抑制Jurkat细胞增殖并诱导其凋亡,抑制LPS刺激后的Balb/c小鼠巨噬细胞释放NO和分泌细胞因子TNF-α。及促进Balb/c小鼠脾淋巴细胞增殖,调节细胞因子IL-2、IL-4、IL-10和TNF-α的分泌水平,因此Lfcin B和Lfcin H起到了抗肿瘤、抗炎症和免疫调节作用,Lfcin B与Lfcin H在这三个功能性质上具有同等功效,只是在剂量上稍有差别,本研究为下一步的体内实验打下了良好的基础,也为来源广泛的牛乳组分替代母乳提供了实验支撑,丰富了天然抗肿瘤药物的研制工作,也为婴儿配方奶粉及免疫调节食品的开发开辟了新道路。
【关键词】：牛乳铁蛋白素 人乳铁蛋白素 Jurkat细胞 巨噬细胞 脾淋巴细胞
【学位授予单位】：东北农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：R151
【目录】：

• 摘要10-12
• 英文摘要12-15
• 1 引言15-23
• 1.1 立题背景15-17
• 1.1.1 乳铁蛋白素的发现15-16
• 1.1.2 乳铁蛋白素的结构16-17
• 1.2 乳铁蛋白素的生物学功能及其作用机制17-19
• 1.2.1 乳铁蛋白素抗菌活性17-18
• 1.2.2 乳铁蛋白素抗癌活性18
• 1.2.3 乳铁蛋白素抗炎症和免疫调节活性18-19
• 1.3 细胞增殖、细胞凋亡及细胞因子的概括19-20
• 1.3.1 细胞增殖19
• 1.3.2 细胞凋亡19-20
• 1.3.3 细胞因子20
• 1.4 研究的目的和意义20-21
• 1.4.1 研究目的20-21
• 1.4.2 研究意义21
• 1.5 研究内容21-23
• 2 材料与方法23-34
• 2.1 材料23-25
• 2.1.1 细胞系23
• 2.1.2 乳铁蛋白素23
• 2.1.3 实验动物23
• 2.1.4 实验试剂及耗材23-24
• 2.1.5 仪器设备24-25
• 2.1.6 实验所用试剂的配置25
• 2.2 方法25-34
• 2.2.1 实验前的准备25-26
• 2.2.2 Jurkat细胞的体外培养26-27
• 2.2.3 光学显微镜观察Jurkat细胞形态27
• 2.2.4 MTT法检测Jurkat细胞增殖能力27
• 2.2.5 荧光显微镜观察Jurkat细胞凋亡形态27-28
• 2.2.6 Annexin-FITC/PI双标记法检测Jurkat细胞凋亡率28-29
• 2.2.7 JC-1 标记法检测Jurkat细胞线粒体膜电位29
• 2.2.8 小鼠巨噬细胞的体外分离纯化培养29
• 2.2.9 Griess法测定巨噬细胞NO分泌量29-30
• 2.2.10 ELISA法检测巨噬细胞TNF-α 分泌量30
• 2.2.11小鼠脾淋巴细胞体外分离与培养30-31
• 2.2.12光学显微镜观察脾淋巴细胞形态31
• 2.2.13 CCK-8 法检测脾淋巴细胞的增殖能力31-32
• 2.2.14 CCK-8 法检测T淋巴细胞的增殖能力32
• 2.2.15 CCK-8 法检测B淋巴细胞的增殖能力32-33
• 2.2.16 ELISA法检测脾淋巴细胞细胞因子分泌量33
• 2.2.17统计分析33-34
• 3 结果与分析34-55
• 3.1 LfcinB和Lfcin H对Jurkat细胞的影响34-45
• 3.1.1 Jurkat细胞的培养34-35
• 3.1.2 Lfcin H和Lfcin B对Jurkat细胞形态的影响35-37
• 3.1.3 Lfcin H和Lfcin B对Jurkat细胞增殖率的影响37-38
• 3.1.4 Lfcin H和Lfcin B对Jurkat凋亡形态的影响38-40
• 3.1.5 Lfcin H和Lfcin B对Jurkat细胞凋亡率的影响40-44
• 3.1.6 Lfcin B和Lfcin H对Jurkat细胞线粒体膜电位的影响44-45
• 3.2 LfcinB和Lfcin H对巨噬细胞的影响45-47
• 3.2.1 Lfcin B和Lfcin H对巨噬细胞分泌NO的影响45-46
• 3.2.2 Lfcin B和Lfcin H对巨噬细胞分泌TNF-α 的影响46-47
• 3.3 LfcinB和Lfcin H对脾淋巴细胞的影响47-55
• 3.3.1 Lfcin B和Lfcin H对脾淋巴细胞形态的影响47-49
• 3.3.2 Lfcin B和Lfcin H对脾淋巴细胞增殖率的影响49-51
• 3.3.3 Lfcin B和Lfcin H对脾淋巴细胞分泌细胞因子的影响51-55
• 4 讨论55-62
• 4.1 LfcinB和Lfcin H体外抗癌作用的比较55-58
• 4.1.1 Lfcin B和Lfcin H对Jurkat细胞增殖抑制作用55-56
• 4.1.2 Lfcin B和Lfcin H对Jurkat细胞凋亡诱导作用56-57
• 4.1.3 Lfcin B和Lfcin H对Jurkat细胞凋亡机制的影响57-58
• 4.2 LfcinB和Lfcin H体外抗炎作用的比较58-59
• 4.2.1 Lfcin B和Lfcin H对巨噬细胞释放NO的抑制作用58
• 4.2.2 Lfcin B和Lfcin H对巨噬细胞分泌细胞因子的抑制作用58-59
• 4.3 LfcinB和Lfcin H体外免疫调节作用的比较59-62
• 4.3.1 Lfcin B和Lfcin H对脾淋巴细胞增殖诱导作用59-60
• 4.3.2 Lfcin对脾淋巴细胞分泌细胞因子的抑制作用60-62
• 5 结论62-64
• 致谢64-65
• 参考文献65-72
• 攻读硕士学位期间发表的学术论文72

【共引文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 刘燕群;周宜开;王友洁;李华文;程晋鹏;郝巧玲;任恕;;2,3,7,8-四氯二苯并-p-二恶英诱导肺癌SPC-A1细胞凋亡的研究[J];工业卫生与职业病;2005年06期

2 陈运新;黄月红;张莉娟;陈治新;王小众;;白细胞介素-10基因修饰对大鼠肝细胞系BRL生长的影响[J];福建医科大学学报;2013年05期

3 James Dorcas Bolanle;Kadejo Olubukola Adetoro;Sallau Abdullahi Balarabe;Owolabi Olumuyiwa Adeyemi;;Hepatocurative potential of Vitex doniana root bark,stem bark and leaves extracts against CCl_4-induced liver damage in rats[J];Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine;2014年06期

4 何佳;黄薇薇;孟庆森;姜艳平;崔文;乔薪瑗;葛俊伟;刘敏;李一经;唐丽杰;;表达猪乳铁蛋白的重组乳酸乳球菌对断奶仔猪应用效果的研究[J];动物营养学报;2014年06期

5 张秀娟;李秋实;季宇彬;;细胞死亡方式研究进展[J];哈尔滨医药;2007年06期

6 赵高峰,僧靖静,卫战文,田川,高冬玲,陈奎生,马长路,李全荣,齐宇,马继红,屈清荣,张云汉;食管鳞状细胞癌组织中细胞胀亡与凋亡检测[J];郑州大学学报(医学版);2003年06期

7 赵高峰,僧靖静,刘文超,高冬玲,马继红,孟红印,韩立志,田川,胡伟,付明倜,屈清荣,张云汉,李胜云;化疗后肺鳞癌组织中细胞胀亡和凋亡检测[J];郑州大学学报(医学版);2003年06期

8 邓旭坤;蔡宝昌;徐珊;吕晓宇;殷武;项晓人;王明艳;;顺铂诱导人胃癌细胞SGC7901和人肝癌细胞HepG2凋亡的细胞形态学变化的比较[J];解剖学报;2006年05期

9 苏少辉;陈纪言;周颖玲;谭宁;余丹青;;西罗莫司洗脱支架预防再狭窄量效关系的实验研究[J];岭南心血管病杂志;2008年04期

10 ;In vitro Cytotoxicity of TCDD on SPC-A1 Cells[J];Biomedical and Environmental Sciences;2006年01期

中国博士学位论文全文数据库 前10条

1 郭尹玲;从“湿热变证”论治急性肝损伤的动物实验研究及机制初探[D];成都中医药大学;2010年

2 吕顺艳;血管钠肽对低氧诱导的心肌细胞、心成纤维细胞以及血管平滑肌细胞生长的抑制调节[D];第四军医大学;2002年

3 徐锋;梗阻性黄疸下大鼠肝缺血再灌注损伤肝细胞死亡方式及其防护研究[D];中国医科大学;2006年

4 杜晓宏;肝移植术后Ref-1对缺血再灌注致肝、肾、小肠和肺细胞DNA损伤修复作用的研究[D];吉林大学;2006年

5 韩晓男;实验性肺气肿、肺动脉高压发病机理及中药814防治的进一步研究[D];中国协和医科大学;2000年

6 张旭晨;地鼠实验性肺气肿、肺动脉高压某些发病机理探讨及中药肺舒灵防治作用的观察[D];中国协和医科大学;2000年

7 史耕先;6A8基因的功能研究：蛋白质糖基化和淋巴细胞死亡[D];中国协和医科大学;2000年

8 吴婷;依达拉奉对脑缺血再灌注损伤的保护作用及其机制研究[D];南京医科大学;2006年

9 郝然;参麦注射液对心肌急性缺血缺氧损伤干预作用的研究[D];北京中医药大学;2007年

10 贾志梅;雷米普利对大鼠非梗塞区心肌胶原及细胞凋亡的影响[D];中国医科大学;2006年

中国硕士学位论文全文数据库 前7条

1 俞眉;人SDF-1α的原核表达、纯化及其调控小鼠骨髓造血的实验研究[D];上海交通大学;2007年

2 吴苗苗;氨基酸营养缺乏对泌乳小鼠乳腺与肌肉组织蛋白质代谢相关基因表达影响的研究[D];山东农业大学;2013年

3 张兆美;CXCR7与VEGF在结直肠癌组织中的表达及意义[D];山西医科大学;2014年

4 匡林华;葡萄糖对糖尿病患者外周血内皮祖细胞的影响及机制研究[D];南昌大学;2014年

5 熊慧;体外诱导鸡原始生殖细胞向精子分化的研究[D];佳木斯大学;2014年

6 许雯;骨髓间充质干细胞的分离培养及扩增对其归甾能力影响的机制初探[D];天津医科大学;2012年

7 王婉潇;白杨素衍生物的合成及抗肿瘤活性研究[D];天津科技大学;2014年

  本文关键词：不同来源Lfcin的抗肿瘤、抗炎症及免疫调节作用的对比研究，由笔耕文化传播整理发布。

本文编号：354573