全氟烷基化合物与人肝脏脂肪酸结合蛋白相互作用研究

发布时间：2017-05-11 10:01

  本文关键词：全氟烷基化合物与人肝脏脂肪酸结合蛋白相互作用研究，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：全氟烷基化合物(perfluoroalkyl substances, PFAAs)是一类结构与脂肪酸类似,具有生物富集性和环境持久性的有机污染物,被广泛应用于民用和工业生产中,在环境样品、生物样品及人体内广泛检出。研究发现,肝脏是PFAAs作用的重要靶器官,一些间接的证据表明PFAAs可以同血清或肝脏细胞中的蛋白(如脂肪酸结合蛋白,FABP等)相互作用,但对其机制尚未有深入研究。肝脏型脂肪酸结合蛋白(liver fatty acid binding protein, L-FABP)在肝脏细胞胞浆中含量丰富,在脂肪酸的转运和代谢中起重要作用,其表达受到过氧化物酶体增殖受体(peroxisome proliferators-activated receptor, PPARα)等核内受体的调控。本研究克隆表达了hL-FABP蛋白和4种突变体(S39G、M74G、N111D、R122G),通过圆二色谱法(CD spectrum)、荧光取代法(fluorescence displacement)、等温滴定量热法(isothermal titration calorimetry,ITC)、胰酶限制性酶切(trypsin limited digestion)和分子对接(molecular docking)等技术和方法,对PFAAs与hL-FABP的相互作用进行研究,以期对二者的作用模式作出准确合理的描述。取得的结果如下：1通过ITC实验和荧光取代实验,证实PFAAs (PFNA、PFOA、PFHxS、PFHxA)可与WT hL-FABP依靠氢键和疏水作用非共价结合,其亲和力随着碳链长度的增加而增强。PFAAs与hL-FABP的亲和力由大到小依次为：PFNAPFOAPFHxSPFHxA。PFOA/PFNA可以以中等强度的亲和力与WT hL-FABP的两个结合位点结合,其结合的摩尔比为1：1。2四种突变体中,R122G和N111D分别在结合摩尔比和亲和力上变化明显：前者结合摩尔比变为0.5：1,后者亲和力明显减弱,S39G和M74G与WT hL-FABP没有明显差异。CD实验、胰酶酶切实验及分子对接结果表明,随着碳链长度的增加,PFAAs对蛋白结构变化的影响也增大,主要表现在α-螺旋含量的增加和β-折叠的减少。R122突变为Gly后,蛋白本身在结构上发生一定改变,即外部结合位点体积明显增大。PFAA的结合对R122G结构则无影响,其原因是上述结构上的变化使PFOA无需"gate keeper"氨基酸转动开启内部结合位点即可进入。3分子对接研究表明第一分子PFAA在N111作用下,以"head-in"模式进入外部结合位点,之后R122δ CH2发生旋转,将第一分子PFAA拖拽进入内部位点,空出的外部结合位点即可结合第二分子的PFAA。因此,PFAAs与hL-FABP的结合同长链脂肪酸类似,与蛋白的内外两个结合位点均可以结合,R122和N111在其结合过程中起关键作用。
【关键词】：全氟烷基化合物 人肝脏脂肪酸结合蛋白 相互作用 表达纯化 点突变
【学位授予单位】：广西师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：

• 摘要3-4
• Abstract4-9
• 第一章 绪论9-21
• 1 全氟烷基化合物(PFAAs)概述9-13
• 1.1 PFAAs的来源9
• 1.2 PFAAs的分布现状9-11
• 1.2.1 PFAAs在环境介质中的分布9-11
• 1.2.1.1 水体9-10
• 1.2.1.2 大气10
• 1.2.1.3 固体介质10-11
• 1.2.2 PFAAs在生物介质中的分布11
• 1.2.3 PFAAs在人体中的分布11
• 1.3 PFAAs的生物转化与代谢11-13
• 1.3.1 组织分布11-12
• 1.3.2 代谢动力学12
• 1.3.3 PFAAs对人的毒理学效应12-13
• 2 肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)概述13-16
• 2.1 肝脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)结构13
• 2.2 L-FABP与脂肪酸及其类似物结合13-15
• 2.3 L-FABP参与脂类代谢调节及其机制15-16
• 3 基因体外表达技术16-17
• 3.1 表达系统16
• 3.2 目的蛋白纯化16-17
• 4 蛋白与小分子相互作用的研究手段17-20
• 4.1 圆二色谱法(Circular dichroism,CD)17-18
• 4.2 荧光光谱法(fluorescence spectroscopy)18-19
• 4.2.1 荧光猝灭法18-19
• 4.2.2 荧光敏化法19
• 4.3 等温滴定量热法(Isothermal Titration Calorimetry,ITC)19
• 4.4 分子对接(Molecular Docking)19-20
• 5 本研究的目的、意义及研究路线20-21
• 第二章 WT hL-FABP及四种突变体表达与纯化21-30
• 1 主要试剂21
• 2 pET28a-hL-FABP质粒及其突变质粒的构建21-24
• 2.1 培养基配方21-22
• 2.1.1 LB培养基21
• 2.1.2 SOC培养基21-22
• 2.2 目的基因hL-FABP扩增22-23
• 2.2.1 人肝细胞(HL-7702)总RNA提取22
• 2.2.2 cDNA模板的制备(2步法)22
• 2.2.3 hL-FABP的PCR扩增22-23
• 2.3 pET28a-hL-FABP质粒构建23
• 2.4 pET28a-hL-FABP突变质粒构建23-24
• 2.4.1 突变凝血酶酶切位点24
• 2.4.2 突变关键氨基酸残基位点24
• 3 野生型hL-FABP(WT hL-FABP)及其四种突变体的表达纯化24-27
• 3.1 hL-FABP过表达24-25
• 3.2 hL-FABP纯化25-27
• 4 hL-FABP表达纯化实验结果27-30
• 4.1 质粒构建电泳结果27-28
• 4.2 考马斯亮蓝染色检测蛋白过表达结果28
• 4.3. 考马斯亮蓝染色检测蛋白纯化结果28-30
• 第三章 hL-FABP与PFAAs相互作用研究30-52
• 1 实验材料与方法30-35
• 1.1. 主要试剂30
• 1.2 圆二色谱检测30-31
• 1.2.1 实验仪器30
• 1.2.2 实验方法30-31
• 1.3 荧光取代实验31-32
• 1.3.1 实验仪器31
• 1.3.2 实验方法31-32
• 1.4 等温滴定量热法(ITC)32-33
• 1.4.1 实验仪器32
• 1.4.2 实验方法32-33
• 1.5 限制性酶切实验33-34
• 1.6 分子对接实验34-35
• 2 hL-FABP与PFAAs相互作用实验结果35-52
• 2.1 圆二色谱结果35-40
• 2.2 荧光取代结果40-43
• 2.3 ITC结果43-49
• 2.4 胰酶酶切结果49
• 2.5 分子对接结果49-52
• 第四章 讨论52-56
• 第五章 总结56-58
• 1 主要结论56
• 2 创新点56-57
• 3 不足与展望57-58
• 参考文献58-64
• 附录64-66
• 1 pET 28a原核表达载体图谱64-65
• 2 主要缩略词表65-66
• 致谢66-68

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