甲基硝基亚硝基胍致哈萨克族正常食管上皮细胞表观遗传改变的研究

发布时间：2017-05-12 18:24

  本文关键词：甲基硝基亚硝基胍致哈萨克族正常食管上皮细胞表观遗传改变的研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的：探讨甲基硝基亚硝基胍(MNNG)对哈萨克族正常食管上皮细胞一般生物学及表观遗传学指标的改变,为哈萨克族食管癌的防治提供理论依据。方法：1联合消化法培养原代哈族食管上皮细胞,细胞形态学和角蛋白免疫组织化学法鉴定细胞。2SV40-T抗原基因转染原代培养的哈族正常食管上皮细胞,获得永生化细胞系,采用RT-PCR法检测SV40-T抗原基因在永生化细胞中的表达。3MTT法检测细胞增殖改变、流式细胞术检测细胞周期改变、AnnexinV-FITC/PI双染法检测细胞凋亡改变。4高效液相色谱法(HPLC)测定基因组DNA整体甲基化水平改变。5甲基化特异性聚合酶链(MSP)法检测P16、FHIT、LRRFIP1、ALDHIL1基因甲基化状态。6RT-PCR和Wersten Blot法检测p16、FHIT、LRRFIP1、ALDHIL1、DNMT1、DNMT3a、DNMT3b基因mRNA和蛋白表达。结果：(1)原代细胞培养8～10d后汇合成片,呈铺路石样生长,免疫组织化学法检测细胞角蛋白表达阳性；(2)通过转染SV40-T获得永生化哈族正常食管上皮细胞,细胞形态和结构保持完好；(3)染毒后各组细胞抑制率均高于对照组(0μg/ml)；各组细胞G0+G1期比例低于对照组,而S期和G2+M期均高于对照组；中、高浓度组细胞凋亡率与对照组相比升高,差异均具有统计学意义(P0.05)；(4)中、高浓度组细胞基因组整体DNA甲基化水平低于对照组,差异均具有统计学意义(P0.05)；(5)高浓度组细胞DNMT1含量高于对照组,差异有统计学意义(P0.05),各浓度组细胞DNMT1活性均高于对照组,差异均具有统计学意义(P0.05)；各浓度组细胞DNMT3a含量及DNMT3a活性均高于对照组,差异均具有统计学意义(0.05)；各浓度组细胞DNMT3b含量高于对照组,差异有统计学意义(P0.05),高浓度组细胞DNMT3b活性高于对照组,差异有统计学意义(0.05)；(6)与对照组比较各浓度组细胞p16、FHIT、LRRFIP1基因甲基化状态没有改变；高浓度组细胞ALDH1L1基因有从部分甲基化向完全甲基化转变的趋势；(7)与对照组比较各浓度组细胞p16、FHIT、LRRFIP1、ALDHIL1、DNMT1、DNMT3α和DNMT3b mRNA及蛋白表达水平均升高,差异均具有统计学意义(P0.05)。结论：(1)成功培养出原代哈族正常食管上皮细胞并建立了永生化哈族正常食管上皮细胞系。(2)MNNG抑制哈族正常食管上皮细胞增殖,将细胞周期阻滞在S期和G2+M期,并促进细胞凋亡。(3)MNNG可降低哈族正常食管上皮细胞基因组DNA整体甲基化水平,使ALDH1L1基因从部分甲基化向完全甲基化转变。(4)MNNG提高了DNMT1、DNMT3a和DNMT3b酶活性,为抑癌基因甲基化提供了基础。MNNG对哈萨克族食管正常上皮细胞一般生物学及表观遗传学指标有一定影响。
【关键词】：哈萨克族 食管上皮细胞 原代培养 MNNG 表观遗传
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-8
• 摘要8-10
• Abstract10-12
• 前言12-15
• 研究内容与方法15-37
• 1 实验材料及试剂15-16
• 1.1 实验仪器及设备15
• 1.2 主要试剂15-16
• 1.3 溶液配制16
• 2 实验方法16-35
• 2.1 哈族正常食管上皮细胞原代培17-18
• 2.2 细胞永生化处理及鉴定18-22
• 2.3 染毒剂量的确定22
• 2.4 MNNG对细胞形态影响22
• 2.5 MNNG对细胞增殖的影响22-23
• 2.6 MNNG对细胞周期的影响23
• 2.7 MNNG对细胞凋亡的影响23
• 2.8 基因组DNA整体甲基化水平检测23-25
• 2.9 DNA甲基转移酶活性检测25-27
• 2.10 MSP法检测p16、FHIT、LRRFIP1、ALDH1L1基因甲基化状态27-30
• 2.11 p16、FHIT、LRRFIP1、ALDH1L1、DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的mRNA表达水平30-33
• 2.12 Western blot法检测p16、FHIT、LRRFIP1、ALDH1L1、DNMT1、DNMT3a和DNMT3b的蛋白表达33-35
• 3 质量控制35
• 4 数据及统计学处理35-36
• 5 技术路线36-37
• 结果37-74
• 讨论74-82
• 小结82-83
• 致谢83-84
• 参考文献84-91
• 综述91-104
• 参考文献100-104
• 攻读硕士学棚间发表的学术论文104-105
• 导师评阅表105

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前10条

1 邓大君;CpG甲基化与癌变原理研究[J];中国肺癌杂志;2005年03期

2 冶俊玲;蔺小倩;郭新建;王丰梅;;西宁地区回族和汉族胃癌中HP感染率及HER2表达与临床病理指标的关系[J];高原医学杂志;2012年03期

3 唐石伏;王庆;庞雅琴;赖延东;肖勇梅;张波;李道传;陈丽萍;杨萍;陈雯;;化学致癌物诱导人胚肾上皮细胞转化模型的构建[J];环境与健康杂志;2010年05期

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本文编号：360549