舟山地区蜱虫病毒组学及间接ELISA检测Dabieshan病毒的初步研究

发布时间：2023-02-13 19:50

　　研究目的蜱虫是仅次于蚊类的第二大类媒介节肢动物,具有生命周期长,分布广泛,宿主可选择范围大等特点。经蜱虫可以传播细菌、病毒、螺旋体、立克次体、原生动物和寄生虫等病原微生物,其中不乏对人类和动物具有高度致病性的病原体。随着深度测序技术的飞速发展,将蜱虫病毒组学研究和高通量测序技术相结合,丰富了人们对于蜱虫携带病毒多样性的认知,发现了许多与已知病毒存在巨大差异的新型病毒。为深入了解浙江舟山地区蜱虫携带病毒谱的情况,本课题选择浙江舟山群岛的衢山岛、舟山岛和岱山岛三个岛屿,作为蜱虫采集点,进行蜱虫采集和高通量测序,并对测序发现的病毒谱进行了进一步研究。研究方法和结果1.标本采集及宏基因组测序采集上述三地蜱虫共计421只,蜱虫种类经形态学初步分类后,针对蜱虫线粒体16s核糖体RNA设计特异性引物,PCR鉴定为长角血蜱Haemaphysalis longicornis和镰形扇头蜱Rhipicephalus haemaphysaloides。选取三个采集地点各20只蜱虫进行高通量测序,对测序结果进行整理,结果共计获得23,915,810条读长(reads),经拼接后有10,106,532条reads...

【文章页数】：81 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
中英文缩略语索引
第一章 前言
    1.1 概述
    1.2 蜱虫的种类
    1.3 蜱虫的生理特性
    1.4 几种重要的蜱传病毒
        1.4.1 克里-米亚刚果出血热病毒(Crimean-Congo hemorrhagic fever virus)
        1.4.2 蜱传脑炎病毒(Tick-borne Encephalitis virus)
        1.4.3 发热伴血小板减少综合征病毒(severe fever with thrombocytopenia syndrome virus)
        1.4.4 哈特兰德病毒(Heartland Virus)
    1.5 NGS技术的应用
    1.6 浙江舟山地区疾病流行特点
第二章 蜱虫病毒宏基因组学研究
    2.1 实验材料
        2.1.1 蜱虫样本
        2.1.2 主要试剂
        2.1.3 实验仪器与耗材
        2.1.4 生物信息学分析软件
    2.2 实验方法
        2.2.1 蜱虫的采集
        2.2.2 蜱虫组织DNA提取
        2.2.3 PCR鉴定蜱虫种群
        2.2.4 高通量测序样本处理
        2.2.5 宏基因测序流程
        2.2.6 宏基组学注释
        2.2.7 PCR检测已注释病毒
        2.2.8 PCR反应产物鉴定
        2.2.9 PCR反应产物纯化
        2.2.10 克隆培养及质粒提取
        2.2.11 Dabieshan病毒基因组扩增
        2.2.12 病毒系统进化分析
    2.3 结果
        2.3.1 样本采集
        2.3.2 病毒宏基因组学分析
        2.3.3 Dabieshan病毒检测
        2.3.4 DSP4 病毒检测
        2.3.5 ZSP7 病毒检测
        2.3.6 Bronnoya-like病毒检测
        2.3.7 系统进化分析
    2.4 讨论
第三章 DABIESHAN病毒NP蛋白生物信息学分析
    3.1 材料和方法
        3.1.1 NP蛋白序列预测和进化分析
        3.1.2 NP蛋白结构预测
        3.1.3 NP蛋白一般特性分析
        3.1.4 NP蛋白跨膜域预测
    3.3 结果
        3.3.1 NP蛋白序列分析
        3.3.2 NP蛋白结构分析
        3.3.3 NP蛋白一般特性
        3.3.4 NP蛋白跨膜域预测
    3.4 讨论
第四章 重组NP蛋白的原核表达和多克隆抗体制备
    4.1 实验材料和方法
        4.1.1 实验仪器
        4.1.2 实验试剂
        4.1.3 主要试剂配制
    4.2 实验方法
        4.2.1 构建含酶切位点对的目的片段
        4.2.2 pET-32a空载质粒制备
        4.2.3 空载体质粒和目的片段连接
        4.2.4 重组质粒转化、克隆培养
        4.2.5 诱导原核表达以及表达形式鉴别
        4.2.6 目的蛋白纯化
        4.2.7 多克隆抗体制备
        4.2.8 多克隆抗体纯化
        4.2.9 多克隆抗体特异性鉴定
    4.3 结果
        4.3.1 重组质粒PCR验证
        4.3.2 蛋白表达纯化
        4.3.3 血清多克隆抗体效价测定
        4.3.4 多克隆抗体特异性鉴定
    4.4 讨论
第五章 间接ELISA方法建立和人群血清学初步检测
    5.1 实验材料
        5.1.1 血清标本
        5.1.2 实验仪器和试剂
        5.1.3 相关软件
    5.2 实验方法
        5.2.1 血清反应特异性检测
        5.2.2 包被NP抗原最佳浓度的确定
        5.2.3 酶标二抗最佳浓度的确定
        5.2.4 底物作用最佳时间的确定
        5.2.5 板内重复性检测
        5.2.6 人群血清学初步检测
    5.3 实验结果
        5.3.1特异性实验
        5.3.2 棋盘滴定法确定最佳包被浓度
        5.3.3 确定最佳二抗作用浓度
        5.3.4 显色时间的确定
        5.3.5重复性实验
        5.3.6 人群血清学初步检测
    5.4 讨论
第六章 总结与展望
    6.1 主要结论
    6.2 展望
参考文献
致谢
在校期间发表的论文及在学期间参加学术会议
    1.在校期间发表论文
    2.在学期间参加学术会议



本文编号：3742199