单增李斯特氏菌及副溶血性弧菌适配体的结合机制与应用研究
发布时间：2023-03-25 01:18
适配体是功能性的单链非编码DNA、RNA及其衍生物,可通过形成包括茎环、发夹和G-四链体在内的多种二级结构,以高亲和力和特异性识别、结合靶标,具有稳定性好、成本低、保质期长和易于修饰等独特优势。本研究拟在国内外有关寡核苷酸适配体的研究基础上,以本课题组筛选得到的单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌的适配体为原始序列,通过剪裁、修饰等手段对序列进行优化,以期得到亲和力、特异性和稳定性得到改良的适配体序列。并探讨适配体构象与其亲和力的内在关系,对其与靶标的结合机制进行深入探究。在此基础上利用适配体特异性识别模式,结合三价DNA过氧化物模拟酶(DNAzyme)构建一种方便、新颖、灵敏度高的副溶血性弧菌可视化检测方法。主要工作内容如下:首先,以本课题组筛选得到的单核细胞增生李斯特氏菌和副溶血性弧菌原始适配体序列为基础,以亲和力、特异性和稳定性为评价指标,借助剪裁、锁核酸(LNA)取代和定点突变等优化手段,获得了两条优化后的适配体。其中单增李斯特氏菌优化适配体A15-8仅含24个碱基,通过流式细胞术分析得出其与单增李斯特氏菌的解离常数(Kd)值为32.84±1.33nmol...
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略符号说明
1 绪论
1.1 食源性致病菌及其传统检测技术
1.1.1 微生物检测方法
1.1.2 分子生物学方法
1.1.3 免疫学方法
1.2 适配体
1.2.1 适配体概述
1.2.2 适配体优化方法
1.2.2.1 截短
1.2.2.2 化学修饰
1.2.2.3 二价或多价适配体
1.2.2.4 随机或定点突变
1.2.3 光学适配体传感器在食源性致病菌检测中的应用
1.2.3.1 化学发光法
1.2.3.2 荧光法
1.2.3.3 表面增强拉曼光谱法
1.2.3.4 表面等离子体共振法
1.2.3.5 比色法
1.3 DNA过氧化物模拟酶
1.3.1 DNA过氧化物模拟酶概述
1.3.2 DNAzyme在致病菌检测方面的应用和研究进展
1.4 本课题的立题意义与研究内容
2 实验材料和方法
2.1 实验材料和设备
2.1.1 实验菌种
2.1.2 实验试剂
2.2 主要仪器
2.3 适配体序列的表征
2.3.1 适配体亲和力分析
2.3.2 适配体特异性分析
2.3.3 适配体稳定性分析
2.4 适配体功能化MNP捕获效率的考察
2.4.1 氨基化磁珠的制备与表征
2.4.2 氨基化磁珠的适配体功能化
2.4.3 适配体功能化MNP捕获效率的计算
2.4.4 实际样品捕获效率的考察
2.5 细菌表面结合位点的鉴定
2.5.1 细菌表面结合位点的初步确定
2.5.2 利用适配体功能化MNP确定细菌表面结合位点
2.5.2.1 细菌破碎液中靶标的捕获
2.5.2.2 膜蛋白提取液中靶标的捕获
2.6 副溶血性弧菌可视化检测方法的构建
2.6.1 检测原理
2.6.2 适配体传感器的制备
2.6.3 副溶血性弧菌的检测
2.6.4 可行性分析
2.6.5 实验条件的优化
2.6.5.1 适配体功能化MNP与 ssDNA连接条件优化
2.6.5.2 适配体传感器与靶标孵育条件优化
2.6.5.3 催化反应条件优化
2.6.6 特异性实验
2.6.7 副溶血性弧菌的实际样品检测
3 结果与讨论
3.1 单核细胞增生李斯特氏菌适配体的优化、机理研究及简单应用
3.1.1 单增李斯特氏菌适配体的优化
3.1.2 单增李斯特氏菌适配体功能化MNP捕获效率的考察
3.1.2.1 氨基化磁珠的表征
3.1.2.2 亲和素包被的氨基化磁珠的表征
3.1.2.3 磁珠与生物素化适配体连接条件的优化
3.1.2.4 适配体功能化MNP与细菌孵育条件优化
3.1.2.5 适配体功能化MNP富集特异性的考察
3.1.2.6 适配体功能化MNP的靶标捕获性能
3.1.2.7 单核细胞增生李斯特氏菌的实际样品富集应用
3.1.3 单增李斯特氏菌适配体细菌表面结合位点的鉴定
3.2 副溶血性弧菌适配体的优化、机理研究及简单应用
3.2.1 副溶血性弧菌适配体的优化
3.2.2 副溶血性弧菌适配体功能化MNP捕获效率的考察
3.2.2.1 适配体功能化MNP富集特异性的考察
3.2.2.2 适配体功能化MNP的靶标捕获性能
3.2.2.3 副溶血性弧菌的实际样品富集应用
3.2.3 副溶血性弧菌表面结合位点的鉴定
3.2.3.1 细菌表面结合位点的初步确定
3.2.3.2 分子下拉确定细菌表面结合位点
3.3 副溶血性弧菌可视化检测方法的构建
3.3.1 可行性分析
3.3.2 实验条件优化
3.3.2.1 适配体功能化MNP与 ssDNA连接条件优化
3.3.2.2 适配体传感器与靶标孵育条件优化
3.3.2.3 催化反应条件优化
3.3.3 适配体传感器的特异性
3.3.4 副溶血性弧菌检测的线性范围和检测限
3.3.5 副溶血性弧菌的实际样品检验
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
本文编号：3770238
【文章页数】：67 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略符号说明
1 绪论
1.1 食源性致病菌及其传统检测技术
1.1.1 微生物检测方法
1.1.2 分子生物学方法
1.1.3 免疫学方法
1.2 适配体
1.2.1 适配体概述
1.2.2 适配体优化方法
1.2.2.1 截短
1.2.2.2 化学修饰
1.2.2.3 二价或多价适配体
1.2.2.4 随机或定点突变
1.2.3 光学适配体传感器在食源性致病菌检测中的应用
1.2.3.1 化学发光法
1.2.3.2 荧光法
1.2.3.3 表面增强拉曼光谱法
1.2.3.4 表面等离子体共振法
1.2.3.5 比色法
1.3 DNA过氧化物模拟酶
1.3.1 DNA过氧化物模拟酶概述
1.3.2 DNAzyme在致病菌检测方面的应用和研究进展
1.4 本课题的立题意义与研究内容
2 实验材料和方法
2.1 实验材料和设备
2.1.1 实验菌种
2.1.2 实验试剂
2.2 主要仪器
2.3 适配体序列的表征
2.3.1 适配体亲和力分析
2.3.2 适配体特异性分析
2.3.3 适配体稳定性分析
2.4 适配体功能化MNP捕获效率的考察
2.4.1 氨基化磁珠的制备与表征
2.4.2 氨基化磁珠的适配体功能化
2.4.3 适配体功能化MNP捕获效率的计算
2.4.4 实际样品捕获效率的考察
2.5 细菌表面结合位点的鉴定
2.5.1 细菌表面结合位点的初步确定
2.5.2 利用适配体功能化MNP确定细菌表面结合位点
2.5.2.1 细菌破碎液中靶标的捕获
2.5.2.2 膜蛋白提取液中靶标的捕获
2.6 副溶血性弧菌可视化检测方法的构建
2.6.1 检测原理
2.6.2 适配体传感器的制备
2.6.3 副溶血性弧菌的检测
2.6.4 可行性分析
2.6.5 实验条件的优化
2.6.5.1 适配体功能化MNP与 ssDNA连接条件优化
2.6.5.2 适配体传感器与靶标孵育条件优化
2.6.5.3 催化反应条件优化
2.6.6 特异性实验
2.6.7 副溶血性弧菌的实际样品检测
3 结果与讨论
3.1 单核细胞增生李斯特氏菌适配体的优化、机理研究及简单应用
3.1.1 单增李斯特氏菌适配体的优化
3.1.2 单增李斯特氏菌适配体功能化MNP捕获效率的考察
3.1.2.1 氨基化磁珠的表征
3.1.2.2 亲和素包被的氨基化磁珠的表征
3.1.2.3 磁珠与生物素化适配体连接条件的优化
3.1.2.4 适配体功能化MNP与细菌孵育条件优化
3.1.2.5 适配体功能化MNP富集特异性的考察
3.1.2.6 适配体功能化MNP的靶标捕获性能
3.1.2.7 单核细胞增生李斯特氏菌的实际样品富集应用
3.1.3 单增李斯特氏菌适配体细菌表面结合位点的鉴定
3.2 副溶血性弧菌适配体的优化、机理研究及简单应用
3.2.1 副溶血性弧菌适配体的优化
3.2.2 副溶血性弧菌适配体功能化MNP捕获效率的考察
3.2.2.1 适配体功能化MNP富集特异性的考察
3.2.2.2 适配体功能化MNP的靶标捕获性能
3.2.2.3 副溶血性弧菌的实际样品富集应用
3.2.3 副溶血性弧菌表面结合位点的鉴定
3.2.3.1 细菌表面结合位点的初步确定
3.2.3.2 分子下拉确定细菌表面结合位点
3.3 副溶血性弧菌可视化检测方法的构建
3.3.1 可行性分析
3.3.2 实验条件优化
3.3.2.1 适配体功能化MNP与 ssDNA连接条件优化
3.3.2.2 适配体传感器与靶标孵育条件优化
3.3.2.3 催化反应条件优化
3.3.3 适配体传感器的特异性
3.3.4 副溶血性弧菌检测的线性范围和检测限
3.3.5 副溶血性弧菌的实际样品检验
主要结论与展望
主要结论
展望
致谢
参考文献
附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
本文编号：3770238
本文链接：https://www.wllwen.com/yixuelunwen/yufangyixuelunwen/3770238.html
