抑制Beclin1促进TOCP诱导人成神经瘤SH-SY5Y细胞产生凋亡

发布时间：2017-05-20 14:14

  本文关键词：抑制Beclin1促进TOCP诱导人成神经瘤SH-SY5Y细胞产生凋亡，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的 探讨自噬与凋亡在三邻甲苯基磷酸酯（Tri-ortho-cresyl phosphate，TOCP）诱发SH-SY5Y细胞神经毒性中的关系，进一步阐述TOCP神经毒性的作用机制。 方法 1．采用RNAi技术，构建pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表达载体；将重组质粒转染SH-SY5Y细胞，G418筛选出Beclin1稳定低表达的SH-SY5Y细胞系（sh-Beclin1细胞系），RT-PCR与Western blot检测sh-Beclin1细胞系Beclin1基因的mRNA与蛋白表达。 2．不同浓度TOCP（0，0.5mM）分别处理SH-SY5Y细胞与sh-Beclin1细胞48h，MDC染色观察两组细胞系自噬泡的数量变化，Western blot检测两组细胞中LC3-II蛋白的表达。 3．不同浓度TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）分别处理SH-SY5Y细胞与sh-Beclin1细胞48h，Hoechst33258染色观察两组细胞系细胞核形态，流式细胞仪检测两组细胞系细胞周期的变化,Western blot检测两组细胞系凋亡相关基因Bax，Bcl-2，Caspase-3蛋白的表达。 结果 1．测序证实pGenesil-1-Beclin1-shRNA真核表达载体构建成功。荧光显微镜观察、RT-PCR和Western blot技术鉴定Beclin1基因稳定敲减SH-SY5Y细胞系建立成功。 2．MDC染色结果和Western blot结果显示，与对照组SH-SY5Y细胞比较，TOCP (0.5mmol/L)处理sh-Beclin1细胞系48h后，产生自噬泡的数量明显减少，LC3-II蛋白表达明显降低。 3．与对照组SH-SY5Y细胞比较，sh-Beclin1细胞经不同浓度TOCP（0，1.0mM）处理48h后进行Hoechst33258染色，在荧光显微镜下可见细胞核蓝色荧光增强，染色质聚集明显，，且有部分细胞出现细胞核碎裂、溶解，细胞出现典型的凋亡现象，且产生核碎裂的细胞数量随TOCP浓度升高而增加。 4．不同浓度的TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）处理SH-SY5Y细胞和sh-Beclin1细胞48h后，流式细胞仪检测细胞周期结果显示：与对照组SH-SY5Y细胞比较，sh-Beclin1细胞G1期前有亚二倍体凋亡峰的出现，并凋亡细胞数量随着TOCP浓度增高而增多，并呈现剂量-效应关系（P0.05）。 5．不同浓度的TOCP（0，0.25，0.5，1.0mM）处理SH-SY5Y细胞和sh-Beclin1细胞48h后，Western blot检测凋亡相关蛋白结果显示：在SH-SY5Y细胞中，凋亡相关蛋白bcl-2/bax比值无升高或降低趋势，Cleaved-caspase-3蛋白表达无显著变化，在sh-Beclin1细胞中，凋亡相关蛋白bcl-2/bax比值呈降低，并呈剂量-效应关系（P0.05），cleaved-caspase-3蛋白表达无显著变化。 结论 1．干扰Beclin1基因的表达可抑制TOCP诱导的SH-SY5Y细胞产生自噬，Beclin1蛋白在TOCP诱导的自噬中起重要的作用。 2．TOCP诱发Beclin1基因敲减SH-SY5Y细胞系产生线粒体介导的非Caspase-3依赖的凋亡。
【关键词】：三邻甲苯基磷酸酯 Beclin1 RNAi 自噬 凋亡
【学位授予单位】：南华大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：

• 主要英文缩略语索引4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-9
• 前言9-11
• 材料与方法11-25
• 1. 实验材料11-14
• 2. 实验方法14-25
• 结果25-32
• 1 shRNA 真核表达载体的构建25-26
• 2 转染 SH-SY5Y 及稳定细胞系的建立26-28
• 3 MDC 染色观察自噬泡的变化28-29
• 4 western-bolt 检测自噬相关蛋白 LC3-II 表达29
• 5 Hoechst 33258 染色29-30
• 6 流式细胞仪检测细胞周期30-31
• 7 western-bolt 检测凋亡相关蛋白表达31-32
• 讨论32-37
• 结论37-38
• 参考文献38-42
• 附录42-46
• 综述46-55
• 参考文献51-55
• 在读期间发表的科研论文和参与的科研项目55-56
• 致谢56

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前2条

1 龙鼎新;伍一军;蒋伟;;TOCP对人成神经瘤细胞SH-SY5Y的氧化损伤作用[J];中南医学科学杂志;2011年03期

2 常平安;伍一军;;有机磷酸酯诱发的迟发性神经病靶标酯酶的老化机制[J];中国药理学与毒理学杂志;2005年06期

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本文编号：381885