TaqMan探针荧光PCR法定量检测水中大肠埃希氏菌方法建立和应用

发布时间：2017-05-24 13:24

本文关键词：TaqMan探针荧光PCR法定量检测水中大肠埃希氏菌方法建立和应用，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的： 1．应用TaqMan探针实时荧光PCR技术(RT-qPCR)，建立大肠埃希氏菌的快速定量检测方法。 2．优化水中细菌富集和DNA提取方法，以便应用RT-qPCR方法的进行水中大肠埃希氏菌的检测。 3．采用RT-qPCR和多管发酵法同时检测实际水样，验证RT-qPCR方法的准确性。方法： 1．根据大肠埃希氏菌的ydiJ基因，设计引物和探针，并分析其特异性和灵敏性。 2．将分离的目标片断与T载体连接重组，制备大肠埃希氏菌的质粒DNA标准品。 3．优化RT-qPCR反应检测体系，建立标准曲线，并进行方法学评价。 4．通过比较各种水中细菌富集和DNA提取的方法，确定最佳前处理方法组合。 5．采用RT-qPCR检测20份水样，所得结果与多管发酵法比较，以验证所建立方法的准确性。结果： 1．引物ydiJ577的特异性实验结果表明，，所有的大肠埃希氏菌和志贺氏菌标准菌株均为阳性,9株其它非大肠埃希氏菌标准菌株均为阴性; 2．制备大肠埃希氏菌的质粒DNA经测序比对，结果: Identities=90/91(99%),Gaps=0/91(0%)。，标准品纯度：OD260/OD280=0.047/0.026=1.81 3．加标水源水经膜洗脱（L型棒洗脱法），磁珠法提取DNA，所建立的标准曲线线性范围2.3×100～2.3×106CFU/mL (R2:0.996)、检测限可达到2.3CFU/mL。 4． RT-qPCR和多管发酵法检测实际水样所得结果具有相关性，r=0.991, P0.01 结论： 1． RT-qPCR方法有很好的特异性，能够快速、准确地检测水中大肠埃希氏菌。 2． RT-qPCR方法特别适合在中高程度污染的水样中定量检测大肠埃希氏菌。 3． RT-qPCR法可以作为现行标准方法的补充，能够更加准确、及时地评价水体受粪便污染程度。
【关键词】：水 大肠埃希氏菌 PCR 定量检测
【学位授予单位】：苏州大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R123.1
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