DMT1和钙离子通道在星型胶质细胞和脉络丛上皮细胞铅吸收中的作用研究

发布时间：2017-05-24 17:05

  本文关键词：DMT1和钙离子通道在星型胶质细胞和脉络丛上皮细胞铅吸收中的作用研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：研究背景： 铅是最常见的环境重金属污染物之一，在大气、水、土壤中广泛存在。铅可通过呼吸道、消化道和皮肤等途径进入人体，吸收入血后，经过血液循环分布到各组织，可造成全身几乎所有系统和器官的损害，而其中又以中枢神经毒性作用最为受到关注。铅的神经毒性机制目前尚不完全清楚，而其在大脑中的转运和分布规律、不同组织对铅的亲和性共同影响着铅的毒性效应，因此，铅的转运和分布规律及机制是深入揭示铅神经毒性机制的研究基础和重要线索。 关于铅在大脑中转运分布规律和机制目前所知甚少。以往研究发现：二价金属转运体1（divalent metal transporter1, DMT1）、钙离子通道、细胞内吞作用、阴离子交换等均可能参与了细胞的铅转运过程。但是，不同的暴露方式下，不同器官和不同类型细胞中，铅的转运方式存在很大不同，导致铅在不同组织、细胞吸收和分布的巨大差异。因此，研究铅在不同类型神经细胞转运机制的差异及其特点，，阐明相关的重要分子机制，并在此基础上探讨可能的防治措施，是预防医学亟待解决的重要课题。 研究目的： 本研究以SD大鼠、大鼠胶质瘤细胞系C6细胞、大鼠脉络丛上皮细胞系Z310细胞为实验对象，探讨DMT1和钙离子通道在星型胶质细胞和脉络丛上皮细胞铅吸收过程中的不同作用，为阐明铅在大脑不同类型神经细胞中的转运机制、分布规律提供研究基础和科学依据。 研究方法： 1.建立亚慢性铅暴露大鼠模型：21d初断乳雄性SD大鼠，体重65±15g。铅暴露组饮水法给予100ppm醋酸铅，对照组饮水给予100ppm醋酸钠，无限制饮用8周。 2.建立铅染毒细胞模型：大鼠胶质瘤细胞系C6细胞、大鼠永生化脉络丛上皮细胞系Z310细胞、原代星型胶质细胞分别体外培养，铅处理组细胞培养液中加入5μM醋酸铅溶液。 3.采用原子吸收分光光度法检测大鼠血液，大脑海马、脉络丛及C6细胞、Z310细胞中铅含量，采用免疫荧光组化方法检测海马、脉络丛及C6细胞、Z310细胞中DMT1的表达水平及铅暴露对其表达水平的影响。 4.采用Western blot、Real-time RT-PCR方法检测铅暴露对C6细胞、Z310细胞DMT1蛋白与mRNA表达水平的影响。 5.采用钙荧光探针Fluo-3/AM标记技术，激光扫描共聚焦显微镜观察铅对细胞钙离子吸收的影响。 研究结果： 1.铅暴露后，大鼠血液、脑脊液、大脑组织中的铅水平一致性增高。 2.铅对DMT1表达水平的影响：（1）免疫荧光染色结果显示：SD大鼠海马和脉络丛组织中DMT1均有较丰富的表达，低剂量慢性铅暴露并未显著影响DMT1的表达水平，C6细胞和Z310细胞中DMT1表达水平不同，Z310细胞DMT1表达荧光强度显著强于C6细胞（；2）Western-blot、RT-PCR结果显示：铅对上述两种细胞DMT1蛋白和mRNA表达水平均未产生显著影响。 3. DMT1在脉络丛上皮细胞和星型胶质细胞铅吸收中的作用：（1）原子吸收分光光度法结果显示：DMT1siRNA干涉后，C6细胞和Z310细胞铅吸收均显著降低，与C6细胞相比，Z310细胞铅吸收的降低幅度更加显著；（2）使用铁螯合剂DFO使细胞处于缺铁状态，两种细胞铅吸收量出现不同程度增加；而补铁24h后，Z310细胞铅吸收量显著降低，C6细胞铅吸收水平与对照组相比无显著性差异。在细胞培养体系中同时加入等量铅与铁时，两种细胞铅吸收水平均显著降低。 4.激光共聚焦显微镜结果显示：（1）对照组加入钙离子激动剂Bay K8644后，C6细胞中钙荧光强度增高，之后逐渐减弱。与对照组相比，铅预处理组C6细胞加入Bay K8644后，细胞内钙的荧光强度同样增高，其峰值强度与对照组相近，但之后减弱的速度显著加快；（2）而在铅与Bay K8644同时加入的情况下，细胞内钙荧光强度的峰值比对照组显著减弱，出现峰值的时间后移；（3）Z310细胞对照组加入Bay K8644后，细胞中钙荧光强度同样出现增强现象，但显著弱于C6细胞，之后逐渐减弱至对照组水平。与对照组相比，铅预处理组Z310细胞加入Bay K8644后，细胞内钙的荧光强度仅出现轻微增高；（4）而在铅与Bay K8644同时加入的情况下，Z310细胞内钙荧光强度的峰值与对照组接近，但之后减弱的速度慢于对照组。 5.钙离子通道在脉络丛上皮细胞和星型胶质细胞铅吸收中的作用：（1）钙离子通道激动剂处理可引起C6细胞铅吸收水平显著增加，而Z310细胞无显著变化；（2）钙离子通道抑制剂处理后，C6细胞铅吸收水平显著降低，Z310细胞无显著变化。（3）CaCl2预处理未引起两种细胞铅吸收水平的显著变化；CaCl2与铅同时处理细胞时，1mmol/L CaCl2处理组细胞铅吸收量并未发生显著改变，而10mmol/L CaCl2处理后，两种细胞铅吸收量均显著增加。 研究结论 1. DMT1和钙离子通道在C6细胞和Z310细胞铅转运过程中所起的作用不完全一致：C6细胞的铅转运以钙离子通道为主，而Z310细胞的铅转运以DMT1为主。 2.补铁能够减少细胞的铅吸收量，尤其是铁和铅同时存在的情况下，可以显著减少细胞的铅吸收，表现出一定的保护作用，其机制可能与细胞铁水平通过负反馈影响DMT1表达水平，以及铁和铅离子之间的竞争性抑制作用有关。 3.细胞铅吸收过程中，钙的水平对铅吸收无显著影响；共存情况下与钙离子对铅离子吸收也无明显竞争性抑制作用。
【关键词】：铅 C6胶质瘤细胞 永生化脉络丛上皮细胞 DMT1 钙离子通道
【学位授予单位】：第四军医大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2014
【分类号】：R114
【目录】：

• 缩略语表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-15
• 文献回顾15-30
• 实验一 铅暴露大鼠模型的建立30-39
• 1 材料30-32
• 2 方法32-34
• 3 结果34-37
• 4 讨论37-39
• 实验二 DMT1 在 C6 细胞和 Z310 细胞铅转运中的作用39-56
• 1 材料39-42
• 2 方法42-47
• 3 结果47-54
• 4 讨论54-56
• 实验三 钙离子通道对 C6 细胞和 Z310 细胞铅转运的影响56-64
• 1 材料56-57
• 2 方法57-58
• 3 结果58-62
• 4 讨论62-64
• 小结64-65
• 参考文献65-76
• 个人简历和研究成果76-77
• 致谢77

【参考文献】

中国期刊全文数据库 前4条

1 王磊;蔡景霞;;星形胶质细胞存在L-型钙通道的新证据[J];动物学研究;2007年05期

2 徐兆发,李雪飞,李北利,李晶;脉络丛对铅的屏障作用及其病理形态学观察[J];卫生毒理学杂志;2002年02期

3 王福O

本文编号：391399