沉默Keap1基因对角化相关基因和砷代谢相关指标的影响及在砷皮肤角化异常中的作用

发布时间：2017-05-24 22:08

  本文关键词：沉默Keap1基因对角化相关基因和砷代谢相关指标的影响及在砷皮肤角化异常中的作用，，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：目的:以慢病毒介导的Keap1基因沉默的人角质形成细胞株Ha Ca T细胞为模型细胞,研究Nrf2对角化相关基因和砷代谢相关指标的影响及在砷致皮肤毒性中作用,为砷致皮肤毒性机制提供理论依据。方法:1.Keap1 shRNA的构建:利用RNAi技术,以人Keap1基因为靶基因,设计Keap1基因特异性的小干扰RNA,构建其shRNA,重组慢病毒表达载体,并进行测序鉴定。2.慢病毒包装:用重组成功的表达载体转染包装细胞293T,收集、浓缩病毒上清液、测定其滴度;3.Keap1沉默Hacat细胞模型的构建,构建好的三种慢病毒分别感染HaCaT细胞(MOI=5),感染48小时后,用1ug/ml的嘌呤霉素筛选稳定细胞株。4.稳定细胞株的鉴定:筛选出稳定的细胞株,用实时荧光定量(Real-Time Quantitative PCR)检测干扰效率。5.细胞培养与染毒:模型细胞与正常细胞按细胞常规培养方法培养。6.MTT法检测细胞生长状况,确定染毒浓度,染毒浓度别为LC50的1/100、1/50、1/10。7.流式细胞仪检测细胞的凋亡情况:参照相关试剂盒说明书。8.实时荧光定量PCR检测细胞中Nrf2、K1、K10、INV、LOR、NF-кB、N6AMT1 mRNA的表达水平。9.ELISA法检测细胞中COX-2、N6AMT1、SAM、HCY的蛋白表达水平。结果:1.慢病毒干扰载体构建测序结果显示重组载体构建成功。2.慢病毒滴度测试结果:依据滴度(TU/ml)=细胞数×百分比×MOI(1)×病毒稀释倍数×10^3选取最佳滴度的病毒。3.选取Keap1 shRNA1 Hacat细胞,其基因的沉默效率为71%。4.混合砷液染毒2.90μmol/L、5.80μmol/L、29.00μmol/L,分别为低、中、高剂量组,阴性对照组和空白对照组染毒浓度为0μmol/L。5.细胞增殖:2.90μmol/L混合砷液染毒细胞,细胞明显增殖;5.80μmol/L混合砷液染毒细胞72h开始出现明显抑制;29.00μmol/L混合砷液染毒细胞48h开始明显抑制细胞增殖。空白对照细胞增值率略低于0μmol/L染毒组。6.细胞凋亡:2.90μmol/L染毒时,各时间段细胞凋亡率均低于正常对照组,提示2.90μmol/L混合砷液染毒细胞,在促进细胞增殖同时,诱导细胞凋亡率降低;5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒组随着染毒剂量的增加,细胞凋亡率也逐渐增加。7.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默细胞8h、24h后能促进Nrf2、K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA的表达上调;29.00μmol/L的混合砷染毒72h可使Keap1沉默细胞中Nrf2、K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表达下调,差异有统计学意义(P0.05)。8.2.90μmol/L、5.80μmol/L混合砷染毒Keap1沉默细胞能促进N6AMT1、COX-2、SAM、HCY蛋白的表达;29.00μmol/L混合砷染毒Keap1沉默细胞N6AMT1、SAM、HCY蛋白的表达量下降差异有统计学意义(P0.05);29.00μmol/L COX-2蛋白的表达量仍远于对照组且差异有统计学意义(P0.05)。结论:1.细胞增殖:2.90μmol/L混合砷液染毒细胞,细胞明显增殖;5.80μmol/L混合砷液染毒细胞72h开始出现明显抑制;29.00μmol/L混合砷液染毒细胞48h开始明显抑制细胞增殖。空白对照细胞增值率略低于0μmol/L染毒组,提示沉默Keap1基因后Nrf2高表达有利于细胞的增殖,混合砷液对细胞的增殖影响具有时间-剂量依赖性。细胞凋亡:2.90μmol/L混合砷液染毒细胞,在促进细胞增殖同时,诱导细胞凋亡率降低;5.80μmol/L、29.00μmol/L染毒组随着染毒剂量的增加,细胞凋亡率也逐渐增加;随着染毒时间的延长,细胞的凋亡率也上升,提示混合砷液诱导细胞凋亡具有一定的时间-剂量依赖性。2.混合砷染毒Keap1沉默Ha Ca T细胞,Nrf2处于高表达状态,随着染毒时间延长、染毒浓度增加基因有下调趋势,但明显高于未转染组。3.混合砷染毒能使Keap1沉默Ha Ca T细胞中K1、K10、INV、N6AMT1、NF-κB mRNA表达发生改变,随着染毒时间延长、染毒浓度增加能使基因表达逐渐下调。4.Keap1沉默Ha Ca T细胞染毒后在8h、24h检测到LORmRNA表达为阴性,2.90μmol/L、5.80μmol/L染毒组在72h检测到LOR mRNA上调,29.00μmol/L组在48h、72h检测到LOR mRNA上调。5.混合砷染毒能使Keap1沉默Ha Ca T细胞中N6AMT1、COX-2、SAM、HCY蛋白表达发生改变:随着染毒时间延长、染毒浓度增加表达量逐渐下降。6.混合砷液对Keap1沉默HaCa T细胞的毒性作用受时间和浓度交互作用的影响,可推测砷暴露随着染毒时间的延长,染毒浓度的加大对皮肤细胞的损害越严重。
【关键词】：Ha Ca T细胞 细胞活性 基因表达 慢病毒 Real-time PCR ELISA
【学位授予单位】：新疆医科大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：R114
【目录】：

• 中英文缩略词对照表5-8
• 摘要8-10
• ABSTRACT10-12
• 前言12-15
• 材料与方法15-31
• 1 实验材料15-19
• 2 实验方法19-30
• 3. 统计分析30
• 4. 质量控制30-31
• 结果31-58
• 讨论58-64
• 小结64-65
• 致谢65-66
• 参考文献66-72
• 综述72-82
• 参考文献77-82
• 攻读硕士学位期间发表的学位论文82-83
• 导师评阅表83

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