砷暴露与ABCA1基因启动子区DNA甲基化的关系研究

发布时间：2024-07-02 20:15

　　目的:探究砷暴露对巨噬细胞ABCA1启动子区DNA甲基化改变和基因表达的影响,同时明确砷暴露对巨噬细胞胆固醇流出及细胞凋亡的作用。方法:分别以0μM、4μM、8μM、12μM次砷酸钠暴露THP-1巨噬细胞48 h,抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)预处理1 h后与12μM次砷酸钠共暴露48 h,CCK-8法检测细胞活性改变,流式细胞术DCFH-DA染色法检测巨噬细胞内氧化应激情况,激光共聚焦法检测细胞内NADPH氧化酶胞质组分p47phox在细胞内的定位,焦磷酸测序检测ABCA1基因启动子区DNA甲基化情况,实时定量PCR检测ABCA1基因在巨噬细胞内的表达情况,western检测ABCA1蛋白在巨噬细胞内的表达情况。巨噬细胞加入50μg/m L ox-LDL诱导48 h以产生泡沫化巨噬细胞,然后油红染色法检测泡沫细胞内脂质富集情况,总胆固醇和游离胆固醇检测试剂盒检测胆固醇富集和流出情况。最后hoechst染色法、流式细胞术Annexin V-FITC/PI双染法检测巨噬细胞的凋亡情况。结果:THP-1巨噬细胞生存率与砷暴露浓度呈负相关关系,12μM次砷酸钠暴露48 h之后,巨噬细胞生...

【文章页数】：45 页

【学位级别】：硕士

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致谢
摘要
Abstract
英文缩略语表
第一章 引言
第二章 材料和方法
    2.1 主要试剂与仪器
        2.1.1 主要试剂
        2.1.2 主要仪器
    2.2 THP-1巨噬细胞的诱导、培养和实验分组
    2.3 CCK8法检测砷暴露半数抑制浓度
    2.4 流式细胞术检测巨噬细胞内ROS生成
    2.5 激光共聚焦显微镜检测p47phox在巨噬细胞内的定位
    2.6 qRT-PCR检测巨噬细胞内ABCA1基因的表达
        2.6.1 引物稀释
        2.6.2 RNA的抽提
        2.6.3 RNA纯度鉴定
        2.6.4 RNA逆转录为cDNA
        2.6.5 实时定量PCR
    2.7 Western-blot法检测ABCA1蛋白的表达
        2.7.1 蛋白的样本制备
        2.7.2 SDS-PAGE电泳
        2.7.3 转膜
        2.7.4 封闭孵育抗体
        2.7.5 化学发光,凝胶图像分析
    2.8 焦磷酸测序检测ABCA1基因启动子区DNA甲基化情况
    2.9 油红O染色检测巨噬细胞内脂质富集情况
    2.10 Hoechst染色检测细胞凋亡
    2.11 流式细胞术检测巨噬细胞凋亡率
    2.12 数据处理
第三章 结果
    3.1 CCK8法检测砷暴露半数抑制浓度
    3.2 砷暴露增强THP-1巨噬细胞中ROS产生
    3.3 砷暴露增强THP-1巨噬细胞中NADPH氧化酶装配
    3.4 砷暴露促进THP-1巨噬细胞ABCA1基因启动子区DNA甲基化
    3.5 砷暴露抑制THP-1巨噬细胞ABCA1基因的表达
    3.6 砷暴露抑制THP-1巨噬细胞ABCA1蛋白的表达
    3.7 砷暴露促进THP-1巨噬细胞脂质富集抑制胆固醇流出
    3.8 砷暴露促进THP-1巨噬细胞凋亡
第四章 讨论
第五章 结论
第六章 综述
    2.1 砷与活性氧
    2.2 砷与内皮功能紊乱
    2.3 砷与NADPH氧化酶(NOX)
    2.4 砷与脂质分布及炎症标志物
    2.5 小结和展望
参考文献



本文编号：3999949