酿酒酵母镉反应机理及镉拮抗物筛选初步研究

发布时间：2017-06-01 22:11

  本文关键词：酿酒酵母镉反应机理及镉拮抗物筛选初步研究，由笔耕文化传播整理发布。

【摘要】：重金属镉(Cd)是已知的在生物体内最易蓄积的毒物之一,由于镉的生物半衰期长达10-40年,并且排出缓慢,极微量的镉持续不断进入体内就可因长期生物蓄积和生物放大作用,导致肺、肾脏、肝脏、胰腺、甲状腺、心脏和骨骼等多器官组织以及神经、生殖和免疫等系统的损伤。每年,我国重金属镉排放量多达680余吨,被镉污染的土地、农作物不断增加,严重危害居民的食品安全与身体健康。本论文以酿酒酵母为模型,采用平板计数和流式细胞技术检测四种不同浓度镉对酿酒酵母生长繁殖与代谢影响；用表达谱测序方法,检测了镉浓度320μM时,酿酒酵母基因组表达情况；采用平板计数初步筛选获得三种镉拮抗剂。1.平板计数法检测酿酒酵母镉处理后生长情况,结果表明,随着镉浓度的升高,酿酒酵母生长受到明显影响,当镉浓度达到320μM时,酿酒酵母生长完全受到抑制；精密酸度计测量培养液pH,随着金属浓度升高而升高；流式细胞仪(FCM)检测镉处理后细胞氧自由基(ROS)和线粒体膜电位(△Ψm)结果显示,随着镉浓度的升高,细胞内ROS浓度随之升高,△Ψm降低。酶标法检测谷胱甘肽(GSH)浓度,随着镉浓度升高,GSH含量升高。2.分析表达谱测序结果,共有912个DEG,其中415个DEG上调(最高上调8.25倍),497个DEG下调(最高下调5.37倍)；将DEG根据KEGG数据库进行注释归类,共79条代谢途径发生改变,其中对核糖体代谢、硫代谢、氧化压力代谢相关、维生素代谢相关及有氧呼吸相关等途径影响最大；根据GO数据库注释归类,分别为生物途径(394条途径)、细胞成分(128条途径)、分子功能(725条途径)三类；根据COG数据库注释归类,分别为蛋白质翻译、核糖体结构和生物合成相关基因(156个DEG),预测功能相关基因(107个DEG),氨基酸转运和代谢(76个DEG)等25个类别中。3.以酿酒酵母作为筛选模型,研究了锌、铁、硒、镁对镉的拮抗作用结果显示,当镉浓度为40μM和160μM时,添加镉拮抗剂锌、铁、硒对拮抗镉均有显著作用；当镉浓度为40μM时,锌、硒、铁作用最佳浓度分别为120μM、15μM、5μM；当镉浓度为160μM时,为320μM,120μM,30μM；当镉浓度为80μM和320gM时,锌、铁和硒的加入对镉的毒性作用拮抗不显著；镁的加入对镉的毒性作用无拮抗效果。通过表达谱分析,研究基因水平镉作用机制,为镉毒性疾病治疗基因靶点的选取提供参考；筛选获得镉拮抗剂,为临床镉毒性疾病治疗药物的选取提供参考。
【关键词】：酿酒酵母 镉 表达谱测序 镉拮抗剂 流式细胞仪
【学位授予单位】：西南交通大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：TS261.11;R114
【目录】：

• 摘要6-8
• Abstract8-13
• 第一章 绪论13-24
• 1.1 镉的毒性作用13-15
• 1.1.1 肾脏毒性13-14
• 1.1.2 致癌作用14
• 1.1.3 骨骼毒性14
• 1.1.4 神经毒性14-15
• 1.2 镉毒性机理15-17
• 1.2.1 镉与氧化损伤15-16
• 1.2.2 镉与DNA损伤16
• 1.2.3 镉与细胞凋亡16-17
• 1.3 镉毒性机理研究模型17-18
• 1.3.1 果蝇17-18
• 1.3.2 拟南芥18
• 1.4 酿酒酵母研究模型18-19
• 1.5 镉拮抗剂概述19-22
• 1.5.1 锌的生理功能19-20
• 1.5.2 硒的生理功能20
• 1.5.3 铁的生理功能20-21
• 1.5.4 钙的生理功能21
• 1.5.5 镁的生理功能21-22
• 1.6 课题研究的目的与内容22
• 1.7 技术路线22-24
• 第二章 酿酒酵母对不同浓度镉反应差异性分析24-33
• 2.1 材料24-26
• 2.1.1 实验菌株24
• 2.1.2 实验试剂与仪器24-25
• 2.1.3 培养基与试剂配制25-26
• 2.2 实验方法26-27
• 2.2.1 酿酒酵母菌株活化26
• 2.2.2 Cd对酿酒酵母生长的影响26
• 2.2.3 Cd对酿酒酵母培养液pH的影响26
• 2.2.4 FCM测定镉对酵母生长影响26-27
• 2.3 结果与讨论27-32
• 2.3.1 Cd对酿酒酵母生长的影响27-28
• 2.3.2 Cd对酿酒酵母培养液pH的影响28-29
• 2.3.3 FCM测定镉对酵母生长影响29-32
• 2.4 本章小结32-33
• 第三章 酿酒酵母镉反应转录分析33-57
• 3.1 材料33-34
• 3.1.1 实验菌株33
• 3.1.2 实验试剂与仪器33-34
• 3.1.3 培养基与试剂配制34
• 3.2 实验方法34-40
• 3.2.1 Cd处理后酿酒酵母RNA的提取34-36
• 3.2.2 表达谱构建与测序36
• 3.2.3 测序数据统计与评估36-37
• 3.2.4 确定基因表达水平及其标准化37-38
• 3.2.5 差异表达筛选分析38
• 3.2.6 功能注释、基因分类和代谢途径分析38-39
• 3.2.7 GSH含量测定39-40
• 3.3 结果与讨论40-56
• 3.3.1 RNA质量检测40-41
• 3.3.2 测序数据统计与评估41-43
• 3.3.3 基因表达分析43-46
• 3.3.4 不同数据库注释分析46-48
• 3.3.5 差异表达基因代谢途径分析48-56
• 3.4 本章小结56-57
• 第四章 基于酿酒酵母模型镉拮抗物的筛选57-66
• 4.1 实验材料57-58
• 4.1.1 实验菌株57
• 4.1.2 实验试剂与仪器57-58
• 4.1.3 培养基与溶剂58
• 4.2 实验方法58-59
• 4.2.1 拮抗物作用浓度的测定58-59
• 4.2.2 拮抗物锌作用时间的测定59
• 4.2.3 拮抗物作用培养基pH测定59
• 4.2.4 统计学分析59
• 4.3 结果与讨论59-65
• 4.3.1 拮抗物锌作用浓度59-60
• 4.3.2 拮抗物锌作用时间的测定60-61
• 4.3.3 拮抗物锌作用培养基pH的测定61-62
• 4.3.4 拮抗物硒作用浓度62-63
• 4.3.5 拮抗物铁作用浓度63-64
• 4.3.6 拮抗物镁作用浓度64-65
• 4.4 本章小结65-66
• 结论66-67
• 致谢67-68
• 参考文献68-76
• 攻读硕士学位期间发表的论文及科研成果76

【参考文献】

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本文编号：413590